基于上转换纳米荧光NaYF4:Yb3+,Er3+快速检测PCT的研究

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降钙素原(Procalcitonin,PCT)是降钙素前体,无激素活性的糖蛋白。由116个氨基酸组成,分子量大约为14kD,由甲状腺C细胞分泌。健康人血中PCT含量低于0.05 ng/m L,细菌感染后会明显升高。动物模型实验显示机体发生脓毒血症时,多组织均能表达PCT。脓毒血症是常见的危重症。全球每年大约有180万重症脓毒血症的病例,其发病速度快,临床病死率高,若并发脓毒性休克,病死率可高达80%。在脓毒血症时,血液中PCT会在2-3h内明显增加,其浓度和炎症的严重程度呈正相关。经过近20年的研究和实践,PCT已经被推荐用于细菌性感染脓毒血症的诊断、分层、治疗监测和预后评估。因此,建立一种快速、简易、灵敏和特异的PCT检测方法,可以更好地早期准确诊断脓毒血症并监测病情的进展,防止脓毒症休克及多器官功能障碍综合征(MODS)等并发症的出现,降低病死率。本论文以上转换发光纳米颗粒(up-converting phosphor nanoparticle,UCNP)-NaYF4:Yb3+,Er3+作为标记探针,结合免疫层析技术(Immunochromatography assay,ICA),采用双抗体夹心法,构建了基于检测线T与质控线C荧光比值T/C定量的PCT上转换荧光免疫层析试纸条的检测模型。本研究中所用NaYF4:Yb3+,Er3+通过溶剂热法所得。利用反相微乳法对UCNP进行改性和二氧化硅包裹,得到分散性好的水溶性UCNP,直径约为50 nm。选用γ-(2,3环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)偶联剂作为硅化的UCNP与PCT单抗JG03结合的桥梁,选用硼酸钠溶液为偶联反应提供碱性环境,本实验优化的最佳硼酸钠溶液的浓度为0.07 mol/L。以UCNP-JG03为荧光探针制备了免疫层析试纸条,试纸条的最佳工艺条件为:标记抗体JG03量为15mg,UCNP-JG03复合物喷在结合垫上的量为1mL/cm,捕获抗体JG05浓度为0.3 mg/m L。最佳检测时间为10 min。在此条件下,以PBS为基质,阳性标本荧光比值为S=T1/C1,阴性标本荧光比值为N=T0/C0,S/N为y轴用于扣除阴性标本的背景信号,PCT标准浓度为x轴,拟合了试纸条定量检测标准曲线,即当PBS中PCT浓度在0.05-40 ng/m L范围内,UCNP-ICA标准曲线具有较好的线性,线性回归方程为y=0.2594x+2.1991(R2=0.9862)。本实验的检测低限为0.02 ng/mL。对临床混合血清标本进行加标回收实验,回收率为96%-102.7%,批内检测变异系数在10%以内,批间检测变异系数在15%以内。基于UCNP的免疫层析检测技术是快速,灵敏定量检测血清中的PCT有效方法。
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