脑缺血耐受（brain ischemic tolerance, BIT）是指器官或组织经受一次或多次短暂的缺血发生后，可激发机体产生内源性保护机制，从而减轻后续脑缺血引起的损伤。近年来研究发现不仅是缺血，其他多种预处理方式如低氧、高温、化学药物等也可诱导脑组织对缺血损伤的耐受。本文分别通过间歇性低压缺氧预处理、脑缺血预处理两种方式诱导大鼠产生脑缺血耐受，探讨GLT-1在其中是否发挥作用。间歇性低压缺氧（Intermittent hypobaric hypoxia, IH）处理常常用来治疗和预防多种疾病，如高血压、冠心病、帕金森氏病和急性髓性白血病，而关于其治疗机制的研究正在进行，例如有报道称，IH预处理可以促进成年大鼠海马神经元的形成，发挥明显的抗抑郁类效应，而且间歇性暴露在低氧环境中其血清促红细胞生成素的表达量可以显著上调，此外IH预处理还可显著降低严重乏氧性缺氧打击后大鼠海马和新皮质区神经元的凋亡，减少行为异常和学习记忆能力的损害。基于上述证据，提示IH预处理可以诱导脑缺血耐受，但其机制尚不明了。我们前期的研究已证实胶质细胞谷氨酸转运体-1（glial glutamate transporter-1, GLT-1），其为中枢神经系统最重要的谷氨酸转运体之一，参与整体情况下脑缺血预处理所诱导的脑缺血耐受；GLT-1的高表达参与海马CA3区和齿状回固有的缺血耐受。因此，我们推测，IH预处理有可能通过上调GLT-1表达诱导脑缺血耐受。本实验的目的在于探讨GLT-1在IH预处理诱导的脑缺血耐受中是否发挥作用，从而为将来脑缺血性疾病的防治提供实验依据。在脑缺血缺氧性损伤时，GLT-1的摄取功能会一过性降低，导致细胞外谷氨酸浓度明显升高，同时在海马可伴有天冬氨酸浓度的升高。抑制性神经递质γ-氨基丁酸有显著的神经保护作用，如中风后γ-氨基丁酸的持续高浓度减弱了缺血后脑组织的损伤。本实验通过脑缺血预处理的方式诱导脑缺血耐受，联合应用微透析技术与高效液相色谱技术，观察在脑缺血耐受诱导过程中脑内氨基酸类神经递质的变化，预先侧脑室注射GLT-1的特异性抑制剂DHK抑制GLT-1的功能，观察对上述过程中氨基酸类神经递质的影响，则可以有效地反应GLT-1的功能变化，为进一步确认GLT-1参与脑缺血耐受诱导提供证据。PPARγ通路被广泛认为是中枢神经系统的自我防御体系，参与减弱脑缺血再灌注的损伤，并发挥内源性保护作用。GLT-1是PPARγ的一个靶基因，PPARγ的激动剂罗格列酮能够引起GLT-1mRNA和蛋白表达上调，同时能够减轻严重氧葡萄糖剥夺所引起的神经元死亡和谷氨酸释放。推测，CIP可能通过PPARγ上调GLT-1的表达减弱缺血再灌注损伤。本室前期研究证明，CIP通过p38MAPK介导GLT-1蛋白表达的上调而诱导脑缺血耐受，而核转录因子-kappa B（nuclear factor kappa B, NF-κB）正是p38MAPK的下游信号分子之一。大量研究证明，NF-κB参与调控GLT-1的表达并在脑缺血时发挥重要作用，例如Ghosh等发现神经元通过NF-κB调节星形胶质细胞的GLT-1转录，Tai等证实阿米替林通过NF-κB引起吗啡慢性鞘内注射大鼠GLT-1及GLAST的表达上调。推测，CIP可能通过NF-κB上调GLT-1表达减弱缺血再灌注损伤。基于以上考虑，我们预先分别经侧脑室注射PPARγ的特异性拮抗剂GW9662及NF-κB的特异性拮抗剂BAY11-7082，通过动态观察海马CA1区谷氨酸、天冬氨酸和γ-氨基丁酸等神经递质浓度的变化，探讨GLT-1在脑缺血耐受中是否被PPARγ、NF-κB信号通路调控。1IH预处理通过上调GLT-1表达诱导脑缺血耐受1.1方法：健康雄性Wistar大鼠（180-220g）57只，随机用于以下三部分研究：1.1.1IH预处理后GLT-1和GFAP的基础表达将12只永久凝闭椎动脉的Wistar大鼠随机分为两组（n=6）：⑴sham组：即假术组，只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流；⑵IH+sham组：IH预处理28d后，行假手术，即只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流。以上各组大鼠在假手术后即刻断头取材，各组分别取3只动物用于免疫组织化学，检测GLT-1和GFAP的表达；其余3只用于Western blot分析GLT-1的表达。1.1.2IH预处理后全脑缺血大鼠GLT-1的表达将24只永久凝闭椎动脉的Wistar大鼠随机分为4组（n=6）：⑴sham组；⑵IH+sham组；⑶损伤性缺血组：夹闭双侧颈总动脉8min造成全脑缺血，然后恢复血流再灌注；⑷IH+损伤性缺血组：IH预处理28d后，夹闭双侧颈总动脉8min造成全脑缺血，然后恢复血流再灌注。以上各组大鼠在损伤性脑缺血或假手术后7d断头取材，分别应用免疫组织化学和Western blot检测GLT-1蛋白的表达。1.1.3DHK对IH预处理诱导的脑缺血耐受的影响将21只永久凝闭椎动脉的Wistar大鼠随机分为7组（n=3）：⑴sham组；⑵IH+sham组；⑶损伤性缺血组；⑷IH+损伤性缺血组；⑸DHK+sham组：sham手术前30min通过右侧脑室注射200nmol DHK，然后进行假手术；⑹aCSF+IH+损伤性缺血组：首先进行IH预处理28d后，全脑缺血前30min通过右侧脑室注射15μl aCSF，然后进行8min全脑缺血；⑺DHK+IH+损伤性缺血组：首先进行IH预处理28d后，全脑缺血前30min通过右侧脑室注射200nmol DHK，然后进行8min全脑缺血。以上各组大鼠在损伤性脑缺血或假手术后7d断头取材，硫堇染色进行神经病理学评价，观察大鼠海马CA1区神经元的存活状况。1.2结果：1.2.1IH预处理上调GLT-1的基础表达通过免疫组织化学染色观察sham组即刻时间点GLT-1的表达，即GLT-1的基础表达，可见海马CA1区GLT-1阳性标记物染色较浅、呈棕黄色，弥散性分布。与sham组相比，IH+sham组海马CA1区的GLT-1阳性标记物明显上调，尤其在锥体神经元之间分布更密集。通过Western Blot观察IH预处理对GLT-1基础表达的影响，与sham组即刻时间点相比，IH+sham组即刻时间点海马CA1区GLT-1蛋白的表达水平显著升高。综合免疫组化和Western Blot结果，一致认为IH预处理上调了海马CA1区GLT-1的基础表达。1.2.2IH预处理上调GFAP的基础表达通过免疫组织化学染色观察GFAP的表达，可见海马CA1区存在散在分布的、棕黄色、呈星状的星形胶质细胞，具有较多突起。Sham组即刻时间点锥体神经元周围分布少量的GFAP阳性颗粒。IH+sham组即刻时间点CA1区GFAP阳性颗粒显著增多，即星形胶质细胞数目明显增多，其胞体大小正常，突起丰富细长，并紧紧包绕着锥体神经元。表明，IH预处理上调GFAP的基础表达。1.2.3IH预处理阻断损伤性脑缺血导致的GLT-1表达下调应用免疫组织化学染色观察各组大鼠7d时间点GLT-1的表达。sham组大鼠海马CA1区GLT-1免疫颗粒染色较浅、弥散性分布。与sham组相比，IH+sham组GLT-1免疫阳性颗粒显著增加。与sham组相比，损伤性缺血组海马CA1区在8min缺血后GLT-1的表达显著降低，尤其在锥体神经元全部死亡的区域及其周围区域。但是当预先给予了28d的IH预处理，然后再进行8min全脑缺血，结果发现海马CA1区的GLT-1表达没有明显降低，即IH预处理显著阻断了损伤性缺血造成的GLT-1下调。通过Western Blot观察各组大鼠7d时间点GLT-1的表达。IH+sham组海马CA1区蛋白的表达量明显高于sham组。而与sham组相比，损伤性缺血组7d时间点在8min缺血后GLT-1的表达显著减少。但是当预先给予了28d的IH预处理，然后再进行8min全脑缺血，结果发现海马CA1区的GLT-1表达没有明显降低，即IH预处理显著阻断了8min全脑缺血造成的GLT-1表达下调。综合免疫组化和Western Blot分析的结果，一致认为IH预处理阻断了8min全脑缺血造成的GLT-1表达下调。1.2.4DHK阻断了IH诱导的脑缺血耐受通过硫堇染色观察各组大鼠7d时间点海马CA1区锥体神经元的迟发性死亡状况。sham组大鼠海马CA1区锥体神经元排列整齐、致密，共2-3层，细胞形态完整、边界清晰、尼氏小体丰富，胞核大而圆、核仁清晰。组织学分级（HG）为0级，神经元密度（ND）为203.53±11.04。IH+sham组7d时间点没有观察到明显的神经元损伤。然而，损伤性缺血组在8min全脑缺血后7d观察到大鼠海马CA1区锥体神经元明显的DND，表现为几乎全部神经元死亡，残存的神经元胞体皱缩，呈多角形或梭形，胞核固缩、浓染，核仁不清或消失。IH+损伤性缺血组CA1区锥体神经元排列整齐、致密，胞核饱满、核仁较清晰，仅见个别锥体细胞核固缩，无明显的细胞缺失，与损伤性缺血组相比，HG明显降低，ND明显增加。提示：28d的IH预处理可以明显抑制8min全脑缺血造成的DND，即IH预处理成功诱导了海马CA1区锥体神经元的缺血耐受。在DHK+sham组，注射200nmol DHK后海马CA1区仅见轻微的DND，证明此剂量的DHK并不会对锥体神经元造成致命损害。aCSF+IH+损伤性缺血组无明显的DND。然而，DHK+IH+损伤性缺血组可见显著地DND，即几乎全部神经元死亡，其ND明显降低，HG明显增加。综上表明，提前给予200nmol DHK可以显著抑制IH预处理诱导的脑缺血耐受。2GLT-1对脑缺血耐受大鼠海马CA1区氨基酸浓度的影响及其分子机制2.1方法：健康雄性Wistar大鼠（280-300g）35只，预先于头部埋置双管，恢复5d后，随机分为以下7组：（1）sham组：水合氯醛腹腔注射麻醉，永久凝闭双侧椎动脉，再暴露颈总动脉并埋置双线。2d后进行微透析，不阻断血流，将穿过的线抽出。（2）CIP组：永久凝闭双侧椎动脉，然后颈总动脉埋置双线。2d后进行微透析时勒紧双线造成缺血，时间为3min。然后将勒紧的线完全松开并抽出，以恢复血流再灌注。（3）损伤性缺血组：实验流程同CIP组，但缺血时间为8min。（4）CIP+损伤性缺血组：首先永久凝闭双侧椎动脉。2d后行CIP实验，当日颈总动脉埋置双线。2d后进行微透析时再勒紧双线进行8min缺血，后恢复血流再灌注。（5）DHK+CIP+损伤性缺血组：基本流程同(4)组。DHK溶液（200nmol,20μl）于微透析时8min缺血前30min注射入侧脑室。（6）GW9662+CIP+损伤性缺血组：基本流程同(4)组。GW9662(2.5nmol,25μl)分别于CIP前30min和CIP后6h注射入侧脑室。（7）BAY11-7082+CIP+损伤性缺血组：基本流程同(4)组。BAY11-7082(2.5nmol,25μl)分别于CIP前30min和CIP后6h注射入侧脑室。收集上述各组的海马CA1区透析液，-80℃保存。然后进行高效液相色谱的荧光检测，观察其透析液中谷氨酸，天冬氨酸和γ-氨基丁酸的浓度随脑缺血处理的变化。2.2结果：2.2.1谷氨酸浓度在各组的变化在sham组，假手术中及其前后谷氨酸浓度基本不变。CIP组中，3min缺血引起了谷氨酸浓度的升高，平均可达基础浓度的1.7倍。在8min损伤性脑缺血组中，缺血开始即有谷氨酸浓度的升高，并迅速升至基础值的7倍左右，在恢复血流再灌注后迅速下降，于4min左右恢复至基础水平。在CIP+损伤性缺血组，谷氨酸在8min缺血后平均升高为基础值的3.9倍，此幅度明显低于8min损伤性缺血组。与CIP+损伤性缺血组相比，3个打药组的谷氨酸浓度均有显著升高。DHK+CIP+损伤性缺血组，8min缺血开始后迅速升至基础浓度的6倍左右，恢复血流再灌注后迅速下降，于4min左右降至基础水平。GW9662和BAY11-7082组谷氨酸的变化趋势与DHK组相似，峰值分别达基础浓度的5.6和4.8倍。2.2.2天冬氨酸浓度在各组的变化在sham组，假手术中及其前后天冬氨酸浓度基本不变。CIP和损伤性缺血组天冬氨酸浓度的变化趋势和谷氨酸相似，峰值分别达基础浓度的2和4.8倍。不同的是，CIP+损伤性缺血组天冬氨酸峰值为基础浓度的5倍，与损伤性缺血组相比无显著差异。在DHK+CIP+损伤性缺血组、GW9662+CIP+损伤性缺血组和BAY11-7082+CIP+损伤性缺血组，天冬氨酸浓度的峰值分别是基础水平的4.5、4.8、4.6倍。2.2.3γ-氨基丁酸（GABA）的浓度在各组的变化sham组，假手术中及其前后GABA的浓度基本不变。CIP组和损伤性缺血组的GABA浓度有明显升高，分别可达基础水平的3.5和8倍，其变化趋势与谷氨酸相似。但是在CIP+损伤性缺血组，可见GABA浓度迅速升高，峰值达到基础值的20倍，提示提前2d的CIP引起了损伤性缺血后更显著的GABA升高。三个打药组在损伤性缺血后同样出现GABA的显著升高，与CIP+损伤性缺血组相比，无明显差异。结论1IH预处理上调GLT-1的基础表达，8min全脑缺血使GLT-1的蛋白表达明显下调，而提前给予28d的IH预处理阻断8min缺血导致的GLT-1表达下调。DHK通过下调GLT-1功能阻断IH预处理诱导的脑缺血耐受。综上表明，IH预处理通过上调GLT-1的表达诱导脑缺血耐受。2CIP显著抑制8min缺血后的谷氨酸浓度升高，此作用可被GLT-1的抑制剂DHK阻断，说明CIP可通过增强GLT-1对谷氨酸的摄取诱导脑缺血耐受。CIP诱导的脑缺血耐受也可被GW9662、BAY11-7082阻断，说明CIP通过PPARγ、NF-κB信号通路上调GLT-1对谷氨酸的转运，诱导脑缺血耐受。3天冬氨酸和GABA在缺血时也升高，提前2d的CIP对8min缺血后天冬氨酸的升高无影响，但使GABA浓度出现了一个更明显的增加。DHK、GW9662、BAY11-7082都对天冬氨酸和GABA的升高无影响。