水稻纹枯菌拮抗细菌的筛选及其活性代谢产物的分离与鉴定

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纹枯病(Sheathblight)是由立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的世界性水稻病害,近年来有日益加重之势。在我国主要依赖井冈霉素防治,但长期、大范围的应用带来了环境生态和抗药性问题。因此,为了提高综防效益,很有必要探索新的防治策略和方法。从土壤中筛选高效拮抗菌株、分离鉴定其拮抗活性组分或化合物用于该病害的生物防治具有广泛的应用前景。本文通过平板稀释法和平板对峙法从蔬菜根际土壤中筛选出1株水稻纹枯菌的高效拮抗细菌,命名为kwkjT4。基于形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析对其分类地位进行了鉴定,利用毒性平板法测定其体外抑菌活性,采用种子细菌化温室试验测定其防治效果。研究了菌株的最适生长条件和拮抗活性物质产生的最适条件。探讨了几种不同极性的有机溶剂提取抑菌活性成分的效果。利用薄层层析和硅胶柱层析分离技术,结合以水稻纹枯病菌为指示菌的抑菌活性测定,从菌株的无细胞发酵滤液中分离抑菌活性物质组分,并采用气相色谱/质谱联用(GC/MS)对其活性抑菌组分进行了化合物的初步鉴定。结果表明:1、kwkjT4菌株具有明显的体外抑菌活性,相对抑菌率为55.1%;对水稻纹枯病的温室防效达61.9%,效果相当于井冈霉素喷雾,提示该菌株在水稻纹枯病的生物防治方面具有较好的应用前景。2、kwkjT4菌株初步鉴定为假紫色色杆菌(Chromobacteriumpseudoviolaceum)。这是C.pseudoviolaceum拮抗水稻纹枯病菌的首次报道。3、分泌抗菌物质,即抗生作用,是kwkjT4菌株拮抗机理之一。菌株最适生长条件为pH7.0,温度32°C,培养时间为36h,转速180rpm,接种量3%。抑菌活性物质产生的最适培养条件为pH6.0,温度28°C,培养时间为48h,转速180rpm,接种量3%,表明两者并不一致。4、乙酸乙酯是最佳提取溶剂,可以从kwkjT4菌株无细胞发酵滤液萃取出绝大部分抑菌活性代谢产物,萃取相的抑菌活性为53.4%。5、通过硅胶柱层析,从乙酸乙酯萃取物中分离出5个组分(Fr.1-5),其中Fr.2组分的抑菌活性最强,对纹枯病菌生长的抑制率为67.3%,其次是Fr.4(46.2%)和Fr.3(28.5%),Fr.1和Fr.5没有抑菌活性。进一步从Fr.2中分离出3个亚组分(Fr.2-1-3),其中Fr.2-2亚组分对纹枯菌的抑菌效果最好,抑菌活性达72.4%。6、从Fr.2-2中分离并鉴定出13种化合物:Com.1:3-Pyridinecarboxaldehyde,Com.2:1H-Pyrrole-2-carboxylicacid,Com.3:3,4-Methyl-enedioxymandelicacid,Com.4:3-Pyridinecarboxylicacid,Com.5:4,6-Diamino-5-pyrimidinylformamide,Com.6:1H-Imidazole-4-carboxylicacid,Com.7:8-Hydroxy-7-methyl-quinoline, Com.8:3-Pyrrolidin-2-yl-propionic acid,Com.9:4-Amino-6-hydroxy-2-methyl-5-nitrosopyrimidine, Com.10:3-Indoly-lglyoxylic acid, Com.11:3-Benzyl-6-(hydroxymethyl)-2,5-pperazinedione,Com.12:1,2-Benzenedicarboxylic acid, Com.13: Phenylalanine,2,5-diketo-3-hydroxy-6-piperazinyl ester。
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