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产气荚膜梭菌可以引起猪的坏死性肠炎等消化道疾病,在猪体内导致严重的腹泻,发病率和死亡率都较高,给全球的养殖业造成了巨大的经济损失。阿维拉霉素和安普霉素作为动物专用药,对畜禽的消化道疾病具有良好的预防和治疗作用。并且不易产生药物残留,且毒性作用弱,具有极高的安全性,进一步促进了其在兽医临床上的应用。但我国目前养殖业用药的不合理必然导致耐药现象的产生,耐药监测具有必要性和紧迫性。而耐药监测需要耐药判定标准,目前我国并没有相关标准,主要参考CLSI中的折点值。因此,为了监测耐药性产生,分析耐药现状和发展规律,更科学的指导临床用药,本课题参考CLSI中折点制定的方法建立符合我国国情的野生型临界值、药效学临界值和临床临界值,为折点的制定工作提供科学数据。1猪产气荚膜梭菌对阿维拉霉素和安普霉素的野生型临界值的制定使用多重PCR分型,对临床分离的猪产气荚膜梭菌进行鉴定,最终确定120株阳性菌株。使用CLSI推荐的琼脂稀释法分别测定猪产气荚膜梭菌对安普霉素和阿维拉霉素的MIC值,其中安普霉素的MIC50与MIC90均为256 μg/mL,而阿维拉霉素的MIC50和MIC90分别为0.06μg/mL和128 μg/mL。将所测得的MIC数据代入J Turnidge Ecoffinder软件模型模拟分析,最终得出猪产气荚膜梭菌对安普霉素的野生型临界值为1024μg/mL,对阿维拉霉素的野生型临界值为0.25 μg/mL。由于安普霉素野生型临界值过大,即产气荚膜梭菌对安普霉素并不敏感。因此药效学临界值和临床临界值主要围绕阿维拉霉素霉素进行。2猪产气荚膜梭菌对阿维拉霉素的药效学临界值制定通过小鼠毒力实验筛选出致病性较强的菌株,选择野生型临界值附近强致病性菌株HS42,采用微量肉汤稀释法测定阿维拉霉素在肉汤培养基和猪回肠内容物中对该菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),通过平板涂布法将浓缩至1010 CFU/mL的产气荚膜梭菌菌液涂至含阿维拉霉素的琼脂平板测定防突变浓度(MPC),采用药物去除的方法测定阿维拉霉素对产气荚膜梭菌的抗菌后效应(PAE),分别用含有不同浓度阿维拉霉素的培养基和各时间点采集的回肠内容物进行体外和半体内杀菌曲线试验。结果显示在FT肉汤和回肠内容物中的阿维拉霉素对产气荚膜梭菌HS42的MIC均为0.25 μg/mL,MBC均为0.5 μg/mL。阿维拉霉素对产气荚膜梭菌的MPC为3.1μg/mL,说明阿维拉霉素的耐药突变窗较窄,可能是因为其鲜少用来治疗产气荚膜梭菌感染,因此耐药菌较少。将产气荚膜梭菌暴露在不同浓度阿维拉霉素溶液中1h和2 h,诱导产生的PAE分别为0.38 h～1.35 h和0.54 h～1.73 h。体外和半体内杀菌曲线试验结果均显示阿维拉霉素对产气荚膜梭菌的抗菌作用类型为浓度依赖型。选用20 kg左右的断奶仔猪6头,构造回肠瘘管模型,阿维拉霉素给药剂量为4 mg/kg,给药方式为灌胃给药,建立血浆药动模型和消化道药动学模型。给药之后分别在 0.5h、1h、2h、3h、4h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、36 h、48 h 采集肠内容物和血浆,根据建立的高效液相检测方法检测不同时间点血浆和回肠内容物中的药物浓度。实验表明阿维拉霉素在血浆中的药物浓度低于检测限。使用Winnonlin软件中的非房室模型对获得的消化道药动学数据进行模拟,阿维拉霉素在回肠内容物中的 Tmax为4 h,Cmax为 146.3±13.41 μg/mL,AUC 为428.62±14.23 h·μg/mL。利用Sigmoid Emax方程对半体内杀菌曲线试验中(AUC24h/MIC)ex值与产气荚膜梭菌浓度变化对数值进行拟合,计算当E=0、-3、-4时PK/PD参数(AUC24h/MIC)ex参数值分别为21.60 h、36.15 h、53.24 h。药效学临界值的药效学目标选择E=-3时的参数值36.15 h,带入蒙特卡洛模拟10000头猪的数据,得到不同的MIC值下(AUC24h/MIC)ex的达标率,取达标率大于等于90%时的最大MIC为PK/PD临界值,即阿维拉霉素对猪产气荚膜梭菌的PK/PD临界值为8 μg/mL。结合给药剂量公式,计算针对本试验受试菌株,得到的预防、治疗和根除猪产气荚膜梭菌病的日口服给药剂量为0.09 mg/kg、0.13 mg/kg、0.22 mg/kg,对比临床推荐的日口服给药剂量4 mg/kg,分析差异原因,临床推荐的给药剂量并不是专门针对产气荚膜梭菌的剂量,而是针对猪一般腹泻疾病,由于阿维拉霉素在肠道内浓度极高,而产气荚膜梭菌又对其敏感,因此少量的阿维拉霉素即可达到预期的杀菌效果。将日给药剂量转化为饲料添加剂量分别为3.6 mg/kg、5.2 mg/kg、8.8 mg/kg。3猪产气荚膜梭菌对阿维拉霉素的临床临界值研究将66头15 kg～20 kg仔猪随机分为11组:健康对照组6头,不给药不感染;五组阴性对照组,每组6头,分别感染5株不同MIC浓度的菌株,不给药;五组实验组,每组六头,分别感染5株不同MIC浓度的菌株,阿维拉霉素混饲给药治疗。对各组动物进行症状评分,并进行活菌菌落数统计,用以评价临床治愈或失败,统计治愈率。分析治愈率与MIC之间的关系。目前并没有明确统一的方法来制定临床临界值,因此本次实验采用报道比较广泛的三种分析方法对POC和MIC进行数据分析。根据实验结果初步判断临床临界值范围(POC=90%)应在0.06 μg/mL～2 μg/mL之间。首先采用“WindoW”方法计算MaxDiff和CAR,得出其对应的MIC范围为0.06μg/mL～2μg/mL;根据POC与MIC的公式模型,创新性的提出使用非线性回归拟合POC与MIC曲线,得到估计曲线模型,带入POC值90,得出对应MIC范围为0.06μg/mL～0.22μg/mL;使用CART回归树分析得到临床临界值范围为0.16μg/mL～0.25 μg/mL综合分析以上方法,最终确定临床临界值为接近于0.22 μg/mL和0.16 μg/mL的MIC即0.125 μg/mL。根据CLSI公布的折点制定流程图,本实验符合COPD>COWT>COCL,即阿维拉霉素对猪产气荚膜梭菌的最终耐药判定标准值为0.25 μg/mL。