乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,且发病率不断上升,严重危害广大妇女的健康。在过去我国属于乳腺癌的低发国家,但随着人们生活水平的提高和生活方式的西化,近年来的发病率亦呈明显上升趋势,10年来乳腺癌的发病率增加了47%,达到了25／10万,乳腺癌在城市女性中的发病率位于恶性肿瘤第2位,调查数据显示,在中国的北京、上海、广州、深圳四大城市,乳腺癌的发病率已经上升至第1位,乳腺癌已经成为我国女性生命健康的一个重大威胁。所有乳腺癌患者中30%～40%为雌激素受体α(Estrogen Receptor a, ERa)阴性乳腺癌,与ERa阳性乳腺癌患者相比较,其组织分化差,恶性程度较高,术后短时间内较易出现复发和转移,且对内分泌治疗药物如他莫昔芬(三苯氧胺,TAM)不敏感,目前除化疗外尚无其他有效治疗办法。近期研究表明,ERa基因缺失、突变等遗传改变的发生率较低,推测其表达缺失与启动子区CpG岛异常高甲基化有关。因此,如果能够恢复ERa阴性乳腺癌患者的ERa基因表达并探讨恢复表达后的药物治疗方法,对于ERa阴性乳腺癌患者的临床治疗来说具有重大意义。三氧化二砷(As2O3)是中药“砒霜”中的主要成分,早在2500多年前,中国古代就有应用“砒霜”等砷类物质治疗包括恶性肿瘤在内的多种疾病的记载。在1972年,哈尔滨医科大学最早发现“砒霜”的主要成分-亚砷酸(即As2O3),对急性早幼粒细胞白血病(APL)的治疗显示出极好的疗效。近年来有报道As203可通过竞争利用S-腺苷蛋氨酸(S-Adenosyl-L-methionine, SAM),直接和间接抑制DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase)等途径发挥了去甲基化的功能,因此As2O3有可能作为去甲基化剂恢复ERα阴性乳腺癌患者ERα的表达,从而使其重新获得内分泌治疗的机会。有关As2O3治疗恶性肿瘤的文献很多,但治疗乳腺癌的文献为数不多,其中通过去甲基化恢复ERα表达并联用三苯氧胺(TAM)治疗ERα阴性乳腺癌的体内外研究国内外除本实验室外尚未见报道。第一部分正常乳腺组织和乳腺癌组织中DNMT1和ERa的表达与ERa甲基化状态的关系及临床病理学意义材料与方法1.免疫组织化学法和RT-PCR联合检测20例正常乳腺组织和112例乳腺癌组织中DNMT1和ERa蛋白及mRNA的表达情况；2.MS-PCR检测正常乳腺组织、ERα阳性乳腺癌组织、ERα阴性乳腺癌组织中ERα基因启动子的甲基化状态；3.统计学处理：所有数据应用SPSS17.0软件进行处理,以均数±标准差(x±s)表示,两分类变量的比较用Pearson’s χ2检验；两个有序变量之间的相关性检验用Spearman等级相关分析,以α=0.05为显著性检验水准。结果1.免疫组织化学法和RT-PCR联合检测结果显示：正常乳腺组织及ERa阳性乳腺癌组织中DNMT1的蛋白及mRNA阳性表达率较低,分别为10.00%、46.05%和15.00%、48.68%；而在ERα阴性乳腺癌组织中表达较高,为81.11%和88.89%,组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。2. MS-PCR检测结果显示：正常乳腺组织、ERa阳性乳腺癌组织、ERa阴性乳腺癌组织中ERa启动子甲基化阳性率分别为10.00%、36.84%和86.11%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)3.在乳腺癌组织中,ERa蛋白表达与患者年龄、是否绝经、病灶大小、淋巴结转移情况、临床分级及病理类型比较均未见相关性(P>0.05),与PR表达情况相关(P<0.05)。DNMT1蛋白表达与患者年龄、是否绝经、病灶大小、淋巴结转移情况、临床分级及病理类型比较均未见明显相关性(P＞0.05)；经Spearman等级相关分析DNMT1的表达和ERα的表达呈负相关关系(P＜0.05)；DNMT1的表达和ERα启动子的甲基化率呈正相关关系(P＜0.05)。第二部分三氧化二砷(As2O3)对ERα阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-435s的去甲基化作用及对增殖的影响材料与方法1. MS-PCR及甲基化测序检测不同浓度As2O3处理前后ERα阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-435s ERa基因甲基化状态的变化；2. RT-PCR检测不同浓度As2O3处理前后ERα阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-435s DNMT1及ERα mRNA相对表达水平的变化；3.免疫组织化学及Western bolt检测不同浓度As2O3处理前后ERα阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-435s DNMT1和ERα蛋白表达水平的变化；4.MTT法检测不同浓度As2O3处理后联用TAM对ERα阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响；5.统计学处理：所有数据应用SPSS17.0软件进行分析,结果以均数±标准差(x±s)表示,多个样本均数的比较采用单因素方差分析法(One-way ANOVA),以α=0.05为显著性检验水准。结果1. MS-PCR结果显示：经As2O3处理后ERα基因出现不同程度的去甲基化条带,且在一定浓度范围内呈剂量依赖性。甲基化测序显示部分未甲基化的C变为T。2. RT-PCR.免疫组织化学及Western bolt结果显示：经As2O3处理后DNMT1表达受到抑制,而ERα则逐渐恢复表达,且在一定浓度范围内呈剂量依赖性,与对照组相比P＜0.05,其差异具有统计学意义。3.不同浓度As2O3作用24h、48h时,各组细胞增殖均明显受到抑制,抑制率随着剂量的增加而升高,尤以加TAM后抑制更加明显(P＜0.05)。第三部分三氧化二砷(As2O3)和三苯氧胺联用对MDA-MB-435s细胞裸鼠体内移植瘤生长的影响材料与方法1.建立裸鼠移植瘤模型,比较各用药组裸鼠瘤体终重量及终体积的差异；2. MS-PCR及甲基化测序检测各用药组ERα基因甲基化状态的变化；3. RT-PCR、免疫组化及Western bolt检测DNMT1及ERa mRNA及蛋白表达水平的变化；4.统计学处理：所有数据应用SPSS17.0软件进行处理,以均数±标准差(x±s)表示,多个样本均数比较采用单因素方差分析法(One-way ANOVA),以α=0.05为显著性检验水准。结果1.各As2O3用药组的瘤体终重量和终体积均明显降低,且As2O3联用TAM后抑制作用更强,与TAM单用组及生理盐水组相比其差异均具有统计学意义(P＜0.05)。2. MS-PCR结果示各As2O3单用及联用TAM组瘤组织呈现不同程度的去甲基化条带,而TAM单用组及生理盐水组未见明显去甲基化条带。甲基化测序显示部分未甲基化的C变为T。3. RT-PCR)免疫组织化学法及Western blot结果示各用药组随着As2O3剂量增加瘤组织中DNMT1蛋白表达逐渐受到抑制,而ERα则逐渐恢复表达,而生理盐水组及TAM单用组未见明显变化。各As2O3单用及联用组与生理盐水组及TAM单用组相比其差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论1.在乳腺癌组织中,DNMT1的表达和ERa的表达呈负相关关系；DNMT1的表达和ERa的甲基化率呈正相关关系。2.三氧化二砷可以抑制DNMT1活性使ERa阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-435s ERa去甲基化恢复表达；3.恢复的ERa使MDA-MB-435s细胞具有对内分泌治疗的敏感性。这有可能为临床中ERa阴性乳腺癌患者的治疗提供一条新的途径。