论文部分内容阅读
口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSSC)是一种五年生存率较低的口腔恶性肿瘤。随着分子生物学研究领域的不断深人,靶向药物治疗逐渐占据重要位置[1-4]。寻找有效的治疗靶点,制定相应的靶向治疗计划,对提高口腔鳞癌患者的生存率有着非常重要的价值。研究发现:BET蛋白可以使细胞核大分子复合体到达染色质的特定区域,从而调节一系列重要的生命活动[5-6]。BRD4,近年来是BET蛋白的研究热点,在许多恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[7-13]。我们实验组已经证实BRD4与口腔鳞状细胞癌的增殖、侵袭、转移密切相关,可以成为抗癌治疗的重要靶点[14]。BRD4蛋白抑制剂在一些恶性肿瘤的治疗中,正在逐渐应用于临床[15-17]。尽管BRD4蛋白抑制剂在口腔鳞癌中单独使用有一定的治疗作用,但遗憾的是,效果并不十分理想[15]。提高BRD4蛋白抑制剂在恶性肿瘤中的治疗效果,尽管国内外学者开展了一系列研究,但主要围绕在卵巢癌以及肺癌[18-19],在口腔鳞癌中迄今未见有相关论文发表。基于以上事实,进一步研究BRD4蛋白抑制剂在口腔鳞癌中的作用机制,寻找提高治疗效果的方法,有可能获得更大的治疗益处。本研究的目的如下:1、检测BRD4在口腔鳞癌组织中的表达量。2、检测BRD4蛋白抑制剂与EGFR介导的EGFR/PTEN/PI3K/AKT信号通路之间的关系。3、采用PI3K抑制剂BKM120与JQ1协同使用,检测对口腔鳞癌治疗效果的影响。4、探究P13K抑制剂与JQ1协同作用的机制。5、探究EGFR介导的信号通路对JQ1在口腔鳞癌中治疗效果的影响。第一章:BRD4在口腔鳞癌组织中高表达目的:取30例口腔鳞癌组织以及癌旁组织,检测BRD4表达量,进一步验证BRD4可以作为口腔鳞癌的有效的治疗靶点。方法:30例口腔鳞癌组织以及癌旁组织标本均由山东大学口腔医院口腔颂面外科提供,经过伦理委员会许可,所有病人均知情同意并签署知情同意书。采用免疫组织化学技术(SP法),检测BRD4在30例口腔鳞癌组织以及癌旁组织中的表达量,并进行统计学分析。结果:免疫组织化学结果显示:30例口腔鳞癌标本中,BRD4在28例中高表达,表达率高达93%;30例切取的癌旁组织标本中,BRD4均为低表达。与癌旁组织相比,BRD4在口腔鳞癌组织中明显高表达。结论:BRD4在口腔鳞癌组织中高表达,可以作为一个有效的治疗靶点。第二章:BRD4蛋白抑制剂JQ1可以通过EGFR介导的EGFR/PTEN/P13K/AKT信号通路发挥治疗作用目的:检测在口腔鳞癌细胞系中,BRD4蛋白抑制剂JQ1对EGFR介导的EGFR/PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响。方法:在口腔鳞癌Ca127以及Scc25细胞系中,均采用BRD4的小分子抑制剂JQ1进行治疗,本实验采用的JQ1浓度分别为0μM,0.2μM,lμM,5μM,治疗24h后,分别采用 RT-PCR 与 Western-blot 技术检测 EGFR、pEGFR、P-AKT、AKT 以及抑癌基因PTEN的表达量,检测JQ1在口腔鳞癌中的治疗机制。结果:RT-PCR与Western-blot结果均显示:在总的AKT无明显改变的基础上,JQ1可以明显抑制EGFR、pEGFR、P-AKT的mRNA以及蛋白表达量,增加了 EGFR下游的抑癌基因PTEN的表达量。随着JQ1浓度的升高,改变EGFR、pEGFR、P-AKT、PTEN表达的效果逐渐增强。结论:在口腔鳞癌细胞系中,BRD4蛋白抑制剂JQ1可以通过EGFR介导的EGFR/PTEN/PI3K/AKT信号通路发挥治疗作用。第三章:采用BKM120与JQ1协同使用,可以显著提高口腔鳞癌的治疗效果目的:分别采用体内实验与体外实验检测PI3K的抑制剂BKM120与JQ1协同使用,对口腔鳞癌治疗效果的影响。方法:在口腔鳞癌Cal27以及Scc25细胞系中,采用1 μ M的PI3K抑制剂BKM120与不同浓度梯度的JQ1协同治疗,体外实验中,采用CCK8检测Ca127以及Scc25细胞的增殖,采用流式细胞术检测Ca127细胞的凋亡,并且采用Western-blot检测凋亡相关指标caspase-3的表达量。体内实验建立Cal27裸鼠成瘤模型,分别采用BKM120、JQ1或者两者协同治疗,检测治疗效果。结果:体外实验中,CCK8结果显示:与单独使用JQ1或者BKM120相比,协同治疗可以更大程度抑制口腔鳞癌的增殖;流式细胞术显示:采用JQ1与BKM120两种抑制剂协同治疗,能够显著增加Cal27细胞系的凋亡水平;Western-blot结果显示:采用JQ1与BKM120两种抑制剂协同治疗,可以使凋亡相关指标caspase-3明显增强。体内实验结果显示:与单独使用JQ1或者BKM120相比,JQ1与BKM120协同治疗组中裸鼠的肿瘤体积明显减小。结论:在口腔鳞癌中,与JQ1单独用药相比,采用JQ1与BKM120协同治疗,效果显著。第四章:JQ1与BKM120协同治疗的机制在于进一步抑制BRD4与EGFR的表达目的:探究JQ1与BKM120协同作用的治疗机制。方法:在口腔鳞癌Cal27与Scc25细胞系中,实验组采用浓度分别为0.2 μ M,1 μ M,5μM的JQ1与1μM的BKM120协同治疗;对照组采用JQ1或者BKM120单独治疗。治疗24h后,分别采用RT-PCR与Western-blot检测EGFR、P-EGFR与BRD4的表达量。结果:与单独使用JQ1或者BKM120相比,两者协同治疗可以显著降低EGFR、P-EGFR、BRD4的mRNA与蛋白表达量。结论:JQ1与BKM120协同治疗,可以进一步抑制BRD4与EGFR的表达。第五章:EGFR影响口腔鳞癌对BRD4蛋白抑制剂的敏感度目的:探究EGFR介导的信号通路对JQ1在口腔鳞癌中治疗效果的影响。方法:在口腔鳞癌Ca127以及Scc25细胞系中,我们一组采用siRNA抑制EGFR的表达,一组采用2ug/ml的EGF蛋白激活EGFR,另设空白对照组。三组均采用5 u M的JQ1治疗后,分别检测肿瘤细胞的增殖与凋亡;检测BRD4的mRNA以及蛋白表达量,确认各组细胞对JQ1的敏感度。结果:CCK8以及流式细胞仪分析发现:EGFR敲除组可以显著地抑制口腔鳞癌的增殖能力,增加凋亡水平,提高JQ1的治疗效果;采用EGF配体激活EGFR组,得到相反的效果,即可以促进口腔鳞癌的增殖,抑制凋亡。而RT-PCR以及Western-blot结果显示:与EGF蛋白组相比,EGFR敲除组中BRD4的表达量显著降低。结论:EGFR的表达量可以显著影响口腔鳞癌对BRD4蛋白抑制剂的敏感度。