脑卒中(stroke)是严重影响人类身体健康,甚至威胁生命的疾病。在我国,位列疾病死因第一位,每年发生脑卒中的病人达200万。脑卒中分为两类:缺血性脑卒中和出血性脑卒中,在我国缺血性卒中所占的比率为60%-80%。过去认为缺血脑组织无法挽救,脑缺血半暗带理论对于脑卒中的治疗起到突破性的作用,使得脑梗塞的溶栓治疗成为可能。然而,由于治疗时间窗过窄(美国的治疗时间窗为4.5 h,我国的治疗时间窗为6 h),并有出现严重出血并发症的危险,溶栓治疗一直无法广泛应用,即使在发达国家,也仅有约5%的缺血性脑卒中患者能够接受溶栓治疗。因此,寻找一种切实有效的、缓解缺血性脑卒中损伤的神经保护剂的研究具有重要的临床意义。亚甲蓝(Methylene blue,MB),是杂环芳香族化合物,自19世纪被Paul Ehrlich引入生物界,MB已经被广泛应用于临床。MB的主要特性之一是作用迅速,静脉给药5 min内即可到达峰浓度。另一主要特性是对神经组织具有高度亲和力,可以轻易透过血脑屏障并积累在神经组织中。一旦进入细胞,MB很容易在线粒体质子电势的作用下进入线粒体基质中。线粒体是进行能量代谢、维持氧化还原平衡的重要细胞器。它影响着细胞的生死存亡。当细胞处于应激状态,会导致线粒体受到损伤。引起线粒体膜电位降低,甚至线粒体外膜破裂,释放多种细胞死亡相关蛋白,如细胞色素C、凋亡诱导因子(Apoptosis-Inducing Factor,AIF)等。从而诱导细胞进入凋亡或坏死途径。发生缺血缺氧时,线粒体首先受到损伤,导致线粒体功能紊乱。通过线粒体自噬,清除了功能紊乱的线粒体,同时减少了由功能异常的线粒体产生的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)以及诱导凋亡或坏死的信号分子的释放。最近有研究表明,MB在神经退行性疾病阿尔兹海默氏病中表现出提高自噬分子LC3-II的表达量、降低自噬连接蛋白p62水平的作用。推测MB可能通过促进自噬,起到神经保护的作用。MB可能是潜在的自噬促进剂。到目前为止,仅有四篇MB显著减少脑梗死体积的报道,其中三篇都是心脏骤停复苏引发的全脑缺血再灌损伤。只有一篇应用大脑中动脉闭塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)模型对脑缺血再灌进行的研究。脑缺血再灌损伤和永久性脑缺血存在不同的发病机制。然而,目前尚无MB是否对永久性脑缺血具有保护作用的研究。本研究采用大鼠永久性脑缺血(permanent Middle Cerebral Artery Occlusion,p MCAO)模型模拟永久性缺血性脑卒中。首先观察了MB对于大鼠永久性脑缺血的保护性作用,之后在低氧敏感神经元样细胞PC12上构建细胞氧糖剥夺(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)模型,模拟脑缺血。进一步确认了MB的脑保护作用,并揭示了其可能的作用机制。本研究表明MB能够改善脑缺血24 h所致的神经功能障碍,减少脑梗死体积与细胞坏死,引起线粒体自噬的发生,缓解了线粒体和细胞形态的恶化。在细胞水平,我们证实MB能维持OGD条件下的线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential,MMP,△Ψm),增加线粒体自噬,减少ROS的生成。进一步证明MB是通过引起线粒体自噬,起到对缺血脑组织的保护作用的。主要研究结果如下:1.MB对永久性脑缺血大鼠的神经保护作用1.1 MB缓解了pMCAO大鼠神经功能缺损采取三种方法:Longa评分法、爬格实验、姿势反射与肢体放置测验对p MCAO大鼠神经功能进行评价。在术后24 h,与对照组(VC组)相比,亚甲蓝的低剂量组(L组),中剂量组(M组),高剂量组(H组)三组大鼠神经功能显著改善,其中以MB中剂量组(5 mg/kg)效果最为显著。1.2 MB显著减少pMCAO大鼠脑梗死体积采用TTC染色判断脑梗死体积变化。在我们的实验中,假手术组(S组)大鼠脑组织未见到梗死区域,由大脑中动脉局灶性脑缺血24 h后,VC组大鼠出现了明显的脑梗死灶。M组大鼠与VC组相比,脑梗死体积显著降低约26%,L组、H组也出现了同样的治疗效果。1.3应用MB治疗,大鼠脑组织神经细胞形态得到改善,肿胀细胞率显著降低应用HE染色,光镜观察大鼠脑组织神经细胞形态变化。缺血24 h后,VC组大鼠脑组织缺血灶区域细胞排列疏松、散乱,细胞间隙增大。细胞肿胀,着色变浅,细胞核染色不清,部分胞体皱缩,细胞空泡化。与VC组相比,MB的三个剂量组细胞形态的恶化得到缓解,肿胀细胞率显著降低。1.4 MB显著减少了pMCAO大鼠脑组织坏死神经细胞的数量凋亡和坏死是脑缺血损伤后细胞死亡的主要形式。应用Fluoro-Jade B(FJB)和TUNEL双重荧光染色技术,我们发现脑缺血24 h后神经细胞坏死数量显著增加,与VC组相比,MB的三个剂量组坏死神经细胞数量均显著降低。1.5 MB下调了p MCAO大鼠脑组织坏死相关分子RIP1和RIP3的表达RIP1和RIP3是目前已知的程序性坏死的关键信号分子。应用western blot技术,我们发现,与对侧(未损伤侧)相比,缺血侧(损伤侧)RIP1和RIP3蛋白表达显著升高,而中剂量MB抑制了RIP1和RIP3蛋白表达的上调。提示MB可能对p MCAO大鼠脑组织坏死有对抗作用。2.MB对永久性脑缺血大鼠的神经保护作用机制2.1 MB促进了线粒体自噬,改善了线粒体形态Beclin1、LC3、p62和Tom20是线粒体自噬的重要相关分子,我们通过western blot技术对其含量表达变化进行了检测。与对照侧相比,VC组缺血侧Beclin1的表达显著降低,LC3-II/I比例降低,p62和Tom20表达上调。而应用MB治疗后,无论是在缺血侧还是对照侧大脑半球,与VC组相比,MB都促进了MCAO大鼠脑组织线粒体自噬的发生。借助透射电子显微镜,在MB治疗组大鼠脑组织细胞中我们观察到典型的线粒体自噬体。脑卒中后24 h大鼠脑组织皮层神经元出现明显的线粒体损伤。线粒体嵴紊乱、断裂,线粒体的基质颗粒大量消失,线粒体空泡化。而在MB的三个治疗组,神经细胞的形态得到明显改善。通过线粒体评分的比较,我们发现中剂量MB的神经保护作用最为显著。这些结果提示,MB可能是通过增加线粒体自噬的发生来保证脑缺血后神经细胞线粒体质量的。2.2 MB通过促进线粒体自噬,减少了脑缺血损伤我们构建了PC12的OGD模型,经western blot实验发现在OGD 2 h后,MB促进了Beclin1表达上调,LC3-II/I比例升高以及p62和Tom20表达降低,这些都证明MB具有促进自噬发生的作用。为了验证MB是否是通过增加线粒体自噬来起到对脑缺血损伤的保护性作用的,我们应用流式细胞术检测了自噬抑制剂3-MA对ROS含量变化的影响。我们发现OGD的发生引起ROS的爆发式增加,而MB的使用显著抑制了该现象的出现。但当同时使用自噬抑制剂3-MA时,MB的保护作用被抑制。这些实验数据说明,MB在OGD下促进线粒体自噬发生,减少了ROS的生成,起到保护作用。2.3MB阻止了OGD引起的ΔΨm降低，增加了线粒体自噬的发生实验发现,PC12细胞经OGD处理2 h,ΔΨm陡然降低,MB减缓了这一趋势的发生,然而在常氧状态下,MB也会导致ΔΨm的降低。我们进一步验证了MB是否是通过对ΔΨm的影响来增加线粒体自噬。在实验中加入解耦连剂羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl Cyanide-m-Chlorophenylhydrazone,CCCP),检测线粒体自噬的变化。OGD时PC12细胞线粒体自噬活动被抑制,应用MB,显著增加了线粒体自噬的发生,但当同时使用CCCP时,MB引起自噬发生的作用被抑制。这些现象说明,在OGD情况下,使用MB可以使ΔΨm维持在一个较高的水平,MB通过对ΔΨm的维持,促进了线粒体自噬的发生。综上所述,MB维持了ΔΨm的相对稳定,增加了线粒体自噬的发生,对永久性缺血性脑卒中具有脑保护作用。因此,我们认为MB可能是缺血性脑卒中的潜在的神经保护药物。2.3 MB阻止了OGD引起的△Ψm降低,增加了线粒体自噬的发生