目的骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的骨髓基质干细胞,除了维持造血,越来越多的研究发现其主动参与了肿瘤的发生和发展。研究发现BMSCs具有很好的肿瘤趋向性,而外源性b FGF可以通过活化AKT信号通路体外促进骨髓间充质干细胞的迁移。此外,肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs;tumor-associated fibroblasts,TAFs)作为肿瘤微环境中主要的间质细胞,可以分泌胶原及肿瘤生长转移所必需的一些生长因子参与肿瘤进展。目前,关于CAFs的起源主要有以下几种说法:原位静止的成纤维细胞、上皮间质转化、内皮间质转化以及骨髓起源的间质干细胞。越来越多的研究关注在BMSCs向CAFs的转分化研究,然而具体的诱导分子及其转分化的机制目前仍不清楚。有研究表明b FGF可以活化正常的成纤维细胞,使其转变成α-SMA高表达的激活的成纤维细胞。因此,本研究旨在探索乳腺癌肿瘤条件培养基中的b FGF对BMSCs迁移的作用、BMSCs对乳腺癌体外增殖与体内生长的作用以及b FGF对BMSCs向CAFs的转分化诱导作用及相关的信号传导机制。方法无菌分离BALB/C小鼠BMSCs,形态鉴定后进行体外培养,流式细胞仪鉴定细胞表型。购买的小鼠BMSCs进行流式表型及分化功能鉴定。制备4T1乳腺癌细胞条件培养基(Tumor-conditioned medium,TCM)和BMSCs条件培养基(Bone mesenchyml stem cell-conditioned medium,BMSC-CM)。Wound-healing及Transwell实验检测4T1乳腺癌细胞、TCM、特异性b FGF中和抗体及外源性b FGF对BMSCs迁移能力的影响。台盼蓝实验及MTS比色法检测在正常血清条件(10%FBS)及低血清条件(1%FBS)下BMSC-CM对4T1细胞体外增殖的影响。4T1乳腺癌细胞小鼠移植瘤模型验证BMSCs对乳腺癌的体内生长作用。免疫组织化学染色方法检测各组移植瘤模型增殖细胞核抗原(PCNA)、CD34、α-平滑肌蛋白的的表达。免疫荧光、Western blot实验检测50%TCM、10ng/ml b FGF、10ng/ml TGF-β及50%TCM和特异性b FGF中和抗体(20ng/ml)处理48小时后,BMSCs细胞α-平滑肌蛋白和vimentin蛋白的表达情况。苦味酸-天狼猩红染色检测50%TCM、10ng/ml b FGF、10ng/ml TGF-β及50%TCM和特异性b FGF中和抗体(20ng/ml)处理48小时后,BMSCs细胞胶原纤维的表达情况。RT-PCR检测50%TCM、10ng/ml b FGF、10ng/ml TGF-β及50%TCM和特异性b FGF中和抗体(20ng/ml)处理48小时后,BMSCs细胞α-平滑肌蛋白、vimentin、胶原I及胶原III m RNA的表达情况。Western blot检测10ng/ml b FGF及ERK特异性抑制剂(PD98059)处理48小时后,BMSCs细胞α-平滑肌蛋白、vimentin、ERK、p-ERK、Smad3、p-Smad3的蛋白表达情况。结果1.全骨髓培养法成功分离出小鼠BMSCs,培养的第3代细胞呈明显纤维细胞样,排列有一定的方向性,折光性强。随着传代次数的增加,细胞纯度不断增加。培养的第8代细胞具有较强的增殖活力,细胞纯度较高,细胞表型为CD29+(82.1%)CD44+(93.8%)。其中,CD29+CD44+占82.3%。2.购买的BALB/C小鼠BMSCs具有典型的BMSCs形态,细胞表型为Sca-1+CD29+CD44+CD105+CD11b-CD34-CD45-CD117-。BMSCs在成脂培养基和成骨培养基的诱导下可分化为脂肪细胞和骨细胞。3.Wound-healing实验结果显示:20%TCM组BMSCs迁移的距离较空白对照组未见明显差异,无统计学意义(P>0.05),而50%TCM组BMSCs迁移的距离较空白对照组明显增加(P<0.001)。4.Transwell小室实验结果显示:4T1肿瘤细胞组、50%TCM组、TCM组以及阴性对照组BMSCs迁移的细胞数分别为38±3、50±2、53±8、22±6,4T1组迁移的BMSCs细胞数较空白对照组增加(P<0.05),50%TCM组、TCM组迁移的BMSCs细胞数较对照组明显增加(P<0.01)。5.Wound-healing实验结果显示:50%TCM组BMSCs迁移的距离较空白对照组增加(P<0.05),而50%TCM+FGF-Ab组BMSCs迁移的距离较50%TCM组缩短(P<0.05)。6.Transwell小室实验结果显示:50%TCM组、TCM组、50%TCM+FGF-Ab组、TCM+FGF-Ab组以及阴性对照组迁移的BMSCs细胞数分别为90±13、111±5、57±6、72±18、61±20,50%TCM及TCM组迁移的细胞数较空白对照组增加(P<0.05),而50%TCM+FGF-Ab组迁移的细胞数较50%TCM组减少(P<0.05)。TCM+FGF-Ab组迁移的细胞数较TCM组也减少(P<0.05)。7.Wound-healing实验结果显示:10ng/ml b FGF组、50ng/ml b FGF组BMSCs迁移的距离较空白对照组增加(P<0.01),而且50ng/ml b FGF组细胞迁移的距离较10ng/ml b FGF组增加,呈剂量依赖性(P<0.01)。8.Transwell小室实验结果显示:10ng/ml b FGF组、50ng/ml b FGF组以及阴性对照组迁移的BMSCs细胞数分别为55±6、78±8、32±5。10ng/ml b FGF组、50ng/ml b FGF组迁移的细胞数较空白对照组明显增加(P<0.05,P<0.001),而且50ng/ml b FGF组迁移的细胞数较10ng/ml b FGF组增加(P<0.001)。9.50%TCM、50%TCM+FGF Ab、TCM、TCM+FGF Ab、10ng/ml b FGF、50ng/ml b FGF作用于BMSCs12h后,与对照组相比,各组对BMSCs的增殖均无影响(P<0.05)。10.Western Blot实验结果显示小鼠BMSCs表达FGFR1,且b FGF作用后不影响BMSCs FGFR1的表达。11.台盼蓝计数实验结果显示:正常血清(10%FBS)培养条件下,对照组、20%BMSC-CM组、50%BMSC-CM组的4T1细胞数分别为4.43±0.5(×10~4)、6.20±0.46(×10~4)、10.58±0.94(×10~4)。低血清(1%FBS)培养条件下对照组、20%BMSC-CM组、50%BMSC-CM组的4T1细胞数分别为1.83±0.38(×10~3)、5.75±0.25(×10~3)、10.83±2.92(×10~3)。实验结果显示在正常血清及低血清培养条件下,BMSC-CM均能促进4T1乳腺癌细胞的增殖(P<0.05)。随着BMSC-CM浓度的增加,4T1乳腺癌细胞的细胞数逐渐增加,呈浓度依赖性(P<0.01)。12.MTS比色法结果显示:20%及50%BMSC-CM组的4T1乳腺癌细胞吸光度值(A值)分别为1.467±0.162及1.645±0.084,两组吸光度显著高于对照组(0.900±0.008)(P<0.05)。13.4T1乳腺癌细胞裸鼠移植瘤模型结果显示:4T1细胞单注射组、BMSCs和4T1细胞共注射组、TCM预处理7天的BMSCs和4T1细胞共注射组的瘤块体积分别为688.86±105.85、973.90±95.68、1223.17±167.39(mm3),瘤重分别为475.59±73.50、697.73±39.93、834.77±119.82(mg)。与4T1细胞单注射组相比,BMSCs和4T1细胞共注射组的肿瘤体积及肿瘤重量更大(P<0.05)。与4T1细胞单注射组相比,TCM预处理7天的BMSCs和4T1细胞共注射组的肿瘤体积及肿瘤重量更大(P<0.05)。与BMSCs和4T1细胞共注射组相比,TCM预处理7天的BMSCs与4T1细胞共注射组的肿瘤体积及肿瘤重量更大,但没有统计学意义(P>0.05)。14.免疫组织化学染色发现BMSCs和4T1细胞共注射组及TCM预处理7天的BMSCs与4T1细胞共注射组肿瘤细胞PCNA的表达明显高于4T1肿瘤细胞单注射组(P<0.001)。15.4T1乳腺癌细胞裸鼠移植瘤模型肿瘤表面坏死率结果显示:4T1细胞单注射组、BMSCs和4T1细胞共注射组、TCM预处理7天的BMSCs和4T1细胞共注射组的肿瘤表面坏死率分别为26.86±8.23(%)、5.96±3.46(%)、5.05±3.10(%)。与4T1细胞单注射组相比,BMSCs和4T1细胞共注射组、TCM预处理7天的BMSCs和4T1细胞共注射组的肿瘤表面坏死率更小(P<0.001)。16.免疫组织化学染色结果显示:与4T1细胞单注射组相比,BMSCs和4T1细胞共注射组、TCM预处理7天的BMSCs与4T1细胞共注射组CD34阳性的微血管数目增加(P<0.01)。17.免疫组织化学染色结果显示:与4T1细胞单注射组相比,BMSCs和4T1细胞共注射组及TCM预处理7天的BMSCs与4T1细胞共注射组肿瘤组织间质中α-平滑肌蛋白的表达明显增加(P<0.001)。18.免疫荧光实验结果显示:与对照组相比,50%TCM、10ng/ml b FGF处理后,BMSCs细胞α-平滑肌蛋白和vimentin蛋白表达明显增加。向50%TCM组加入特异性b FGF中和抗体(20ng/ml)后,50%TCM促BMSCs细胞表达α-平滑肌蛋白和vimentin蛋白的作用被抑制。10ng/ml TGF-β处理后,BMSCs细胞α-平滑肌蛋白和vimentin蛋白表达轻度增加。19.Western blot实验结果显示:与对照组相比,50%TCM、10ng/ml b FGF、10ng/ml TGF-β处理后,BMSCs细胞α-平滑肌蛋白和vimentin蛋白表达增加。加入特异性b FGF中和抗体(20ng/ml)后,50%TCM促BMSCs细胞表达α-平滑肌蛋白和vimentin蛋白的作用被抑制。20.苦味酸-天狼猩红染色结果显示:与对照组相比,50%TCM、10ng/ml b FGF、10ng/ml TGF-β处理后,BMSCs细胞胶原纤维的表达增加。加入特异性b FGF中和抗体(20ng/ml)后,50%TCM促BMSCs细胞表达胶原纤维的作用被抑制。21.RT-PCR结果显示:与对照组相比,50%TCM、10ng/ml b FGF处理后,BMSCs细胞α-平滑肌蛋白、vimentin、胶原I及胶原III m RNA的表达水平明显增加(P<0.001)。加入特异性b FGF中和抗体(20ng/ml)后,50%TCM促BMSCs细胞表达α-平滑肌蛋白、vimentin及胶原III m RNA的作用被抑制,而对胶原I m RNA的表达无明显作用。而10ng/ml TGF-β处理后,BMSCs细胞α-平滑肌蛋白和胶原I m RNA的表达增加(P<0.05),而其抑制vimentin及胶原III m RNA的表达(P<0.05)。22.Western blot实验结果显示:10ng/ml b FGF处理后,BMSCs细胞α-平滑肌蛋白、vimentin、p-ERK、p-Smad3的蛋白明显增加,而Smad3和ERK蛋白的表达无明显变化。ERK特异性抑制剂(PD98059)处理后,BMSCs细胞α-平滑肌蛋白、vimentin、p-ERK、p-Smad3蛋白的表达明显降低,而Smad3和ERK蛋白的表达无明显变化。10ng/ml b FGF和PD98059共处理后,BMSCs细胞α-平滑肌蛋白、vimentin、p-ERK、p-Smad3蛋白的表达明显降低,而Smad3和ERK蛋白的表达无明显变化。结论1.采用全骨髓培养法可以成功分离出小鼠BMSCs,经流式细胞仪鉴定细胞表型为CD29+CD44+,纯度在80%以上。但是,冻存后复苏,细胞活力较差。2.购买的小鼠BMSCs流式细胞表型Sca-1+CD29+CD44+CD105+CD11b-CD34-CD45-CD117-,且具有多向分化的潜能。3.乳腺癌肿瘤微环境中的b FGF可以促进BMSCs的迁移,提示b FGF参与了乳腺癌细胞对BMSCs的招募。4.BMSCs促进乳腺癌细胞体外增殖及乳腺癌移植瘤模型体内生长。5.BMSCs促进乳腺癌移植瘤模型血管生成。6.BMSCs促进4T1乳腺癌细胞小鼠移植瘤模型中肿瘤间质α-SMA的表达。7.乳腺癌肿瘤微环境中的b FGF诱导BMSCs分化为CAFs。8.ERK/Smad3信号通路参与了b FGF诱导的BMSCs向CAFs的转分化。