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三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我国重要的海水养殖蟹类,雌雄个体表型性状和经济价值差异显著。因此,建立性别操控技术,实现三疣梭子蟹的单性养殖,能够显著提高经济效益。而筛选性别相关分子标记和基因,解析性别决定机制是建立三疣梭子蟹性别操控技术的必要前提。本研究在实验室前期工作基础上,筛选并验证了1个与三疣梭子蟹性别紧密连锁的分子标记,建立了1种高效的遗传性别鉴定技术,评估了三疣梭子蟹早期发育时期的性别比例(性比),锚定了1个重要的性别相关基因Double Sex。研究结果为建立三疣梭子蟹性别操控技术提供重要依据,同时有助于解析三疣梭子蟹性别决定机制。14-3-3基因是一个高保守的基因,具有参与生物细胞应激、免疫、细胞周期调控、细胞信号转导、代谢酶合成、细胞凋亡等多种生理过程的调控的功能,在多种经济甲壳类动物中已被克隆并初步证明其在抗逆、抗病过程中具有重要作用。然而,至今尚未见该基因在三疣梭子蟹中的相关研究报道。本研究克隆了三疣梭子蟹14-3-3基因c DNA全长,分析了其在主要组织中的表达分布模式、研究其在低盐胁迫及不同病原感染后的表达规律,以此探讨Pt14-3-3在三疣梭子蟹盐度适应和免疫反应中的功能。本文研究内容包括以下四个方面:1.三疣梭子蟹性别连锁分子标记的筛选及验证基于前期实验室三疣梭子蟹性别QTL定位结果,筛选到一个在作图家系中与性别100%连锁的分子标记Marker3840。通过单克隆测序的方法,验证了该标记为一个具有17bp碱基差异的indel标记。为了检验该标记是否在其他家系及群体中也可以用于性别鉴定,本研究利用PCR产物测序的方法将Marker3840标记在2个全同胞家系材料(雌雄各20个个体)及2个群体材料(雌蟹60只、雄蟹59只)中进行标记分型。结果显示,该标记在家系材料中可以100%鉴定性别,在群体材料中鉴定性别的准确率可达到98%,表明该标记可以用于三疣梭子蟹遗传性别鉴定。同时实验发现该标记在雄性中主要为杂合型,而在雌性中主要为纯合型,支持三疣梭子蟹为XY型性别决定型物种,与实验室前期的研究结果一致。2.三疣梭子蟹性别鉴定技术的建立及全同胞家系性比分析根据Marker3840的标记序列特性,在17bp碱基差异位点上下游设计一对能够扩增101bp产物的PCR引物,并借助4%琼脂糖凝胶电泳,成功建立了一种三疣梭子蟹性别鉴定技术。利用该技术仅需通过一步PCR和琼脂糖凝胶电泳即可准确、快速的鉴定遗传性别,检测结果清晰可见,雄蟹电泳条带呈现双条带,而雌性条带呈现单条带。相对于PCR产物测序分型技术,该方法操作简单、成功率高,大大提高了鉴定效率,同时降低了成本。利用该技术对7个全同胞家系Ⅱ期幼蟹(表型未显示性别分化)材料进行性比分析,结果显示其中3个家系性比显著偏离了1:1(1:2.429;1:2.133;1:2)。进一步对这3个家系的大眼幼体(M)和溞状幼体(Z4)材料进行性比分析,结果显示3个在Ⅱ期幼蟹时期性比偏分离的家系在M和Z4时期雌雄比列均接近1:1,未发生显著偏分离(P>0.05)。上述结果表明:三疣梭子蟹幼体阶段性比总体呈1:1,符合XY型性别决定类型的理论性比。部分家系在Ⅱ期幼蟹发生了性比偏离1:1的现象,推测可能是由于苗期密度过大造成个体间打斗、残食等原因导致。3.三疣梭子蟹Double Sex基因的克隆及表达分析克隆了三疣梭子蟹Double Sex基因c DNA序列全长,该基因全长2484bp,开放阅读框(ORF)798 bp,共编码265个氨基酸。进化树分析结果显示:该基因首先与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的Doublesex基因聚为一支,然后再与东方多刺龙虾(Sagmariasus verreauxi)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbetgii)Doublesex基因聚为一支。将该基因在家系(成体雌、雄各20只)和群体(成体雌蟹60只、成体雄蟹59只)DNA材料中进行PCR扩增,发现其几乎只能在雄蟹中扩增,表明其与性别连锁非常紧密,可能为雄性特异基因。利用实时荧光定量PCR探究Double Sex基因在胚胎和幼体不同发育时期的表达规律,结果显示该基因在心跳期和Z3其的表达量较高,分别为囊胚期的18.54倍和6.20倍(P<0.05)(囊胚期表达量最低),推测这两个时期可能为三疣梭子蟹性别分化的关键时期。4.三疣梭子蟹14-3-3基因的克隆及其在低盐和病原胁迫后的表达分析本研究克隆获得三疣梭子蟹14-3-3基因(Pt14-3-3)。序列分析可知Pt14-3-3基因c DNA序列全长为2510 bp,包含开放阅读框741 bp,编码由247个氨基酸组成的蛋白,分子量为27.98 k Da。序列比对结果显示,Pt14-3-3基因与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)14-3-3基因同源性最高(100%)。系统进化树分析表明,Pt14-3-3氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)紧密聚为一支。组织表达分析显示,Pt14-3-3基因在肝胰腺、肌肉、鳃、血淋巴等多组织均有表达,其中,在肝胰腺中表达量最高。低盐胁迫后,Pt14-3-3基因在鳃和肝胰腺中的表达量分别于48 h和12 h显著上调并达到最大值,分别为对照组的1.34倍(P<0.05)和7.54倍(P<0.05)。人工感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和白斑综合征病毒WSSV后,Pt14-3-3基因在肝胰腺和血细胞中整体均呈显著上调表达,最高上调17.52倍(P<0.05)。本研究结果表明,Pt14-3-3基因可能在三疣梭子蟹低盐适应和免疫反应中发挥重要作用。