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近几年来，禽流感病毒（Avian Influenza，AIV)在全世界范围内流行，是养禽业面临的一个巨大挑战。其中H9N2亚型AIV是目前亚洲分布最为广泛的一个低致病性禽流感亚型。虽然低致病性禽流感病毒在临床上主要表现为死亡率不高，但是当和其他细菌、病毒微生物共感染时，容易导致疫病的发生，继而出现较高的发病率和死亡率；该亚型病毒也能够感染人引起人的呼吸系统感染和结膜炎等，即属于人兽共患病病原。研究发现，中国大陆1998年H9N2亚型禽流感病毒大流行的原因是因为病毒获得了气溶胶传播的特性，并且其传播特性和致病能力可能是NA基因结构决定。然而，在NA基因水平上对气溶胶传播及致病力的研究甚少，因此本实验利用反向遗传技术构建重组病毒，然后利用H.E染色及免疫组化技术和气源性传播实验模型研究H9N2亚型AIV气源性传播及其致病力之间的差异。一、R01/NASS和R01/NASS-381重组株病毒的拯救本实验通过基因克隆的方法，利用自己优化设计的带有BsmBI/AarI/BsaI酶切位点的引物以及Webster赠送的流感病毒8质粒系统反向遗传双向转录/表达载体pHW2000，构建出含有PolⅠ-PolⅡ系统的SD01株的8个转录/表达质粒以及SS94株NA基因转录/表达质粒。利用基因定点突变技术分别对SS94株的NA基因381、313、368和370氨基酸位点通过PCR技术定点突变，测序后验证得到含有D381G、K313E、E368D、L370S突变位点的NA基因。然后将SD01株的7个基因转录/表达质粒分别和SS94株NA基因转录/表达质粒（pHWSS6-NA）及SS94株NA基因含有突变位点的转录/表达质粒（pHWSS6-NA381）共同作用细胞板中的293T细胞，分别拯救出R01/NASS和R01/NASS-381重组株病毒。通过测序对比，证明获得目的重组病毒。分别将两株重组病毒株接种9~11日龄健康SPF鸡胚，增强复制能力并用Reed-Muench方法计算EID50以用来测定其毒力。R01/NASS株EID50为8.17±0.20/mL，R01/NASS-381株EID50为9.43±0.40/mL，虽R01/NASS-381株毒力大于R01/NASS株，差异不显著。二、R01/NASS和R01/NASS-381重组株病毒气源性传播的研究利用SPF鸡正负压隔离器，以30只4周龄健康SPF鸡为实验动物，随机等量的分为攻毒组、直接接触组和气溶胶间接感染组三组，以此模型分别测定R01/NASS和R01/NASS-381重组株病毒在鸡群间的传播特性。在攻毒组通过点眼滴鼻接种病毒后24h后放入直接接触组，从第2天开始每隔一天收集一次口咽泄殖腔棉拭子样品，直至第14天；处理棉拭子样品接种9日龄健康SPF鸡胚，通过HA/HI试验测定棉拭子AIV的病毒含量；第4、6、8、10、14天，用AGI-30收集隔离器中空气样品，同样接种9日龄健康SPF鸡胚，测定空气中病毒的含量；接种病毒第7天、14天、21天分别采取血样，处理后通过HA/HI试验测定病毒效价。试验结果表明，接种R01/NASS-381株病毒的传播试验，气溶胶间接接触组鸡群口咽泄殖腔棉拭子检测到病毒并且血样中检测抗体效价，同时也检测到空气中气载型AIV的存在，接种第6天检测到病毒，第8天达到高峰，以后逐渐降低。接种R01/NASS株病毒的传播试验中，只在攻毒组和直接接触组口咽泄殖腔棉拭子检测到病毒以及血样中检测到抗体。气溶胶间接感染组抗体阴性；未收集到气载型AIV颗粒；口咽泄殖腔棉拭子均未检测到病毒存在。传播试验说明，拯救的R01/NASS病毒株未获得气源性传播的能力；然而通过SS94株NA蛋白基因D381G、K313E、E368D、L370S位点突变后，重组R01/NASS-381病毒株获得了在家禽间气源性传播的能力。因此说明了H9N2亚型AIV的NA蛋白381、313、368和370位氨基酸对病毒能否在家禽间气源性传播起到至关重要的作用。三、R01/NASS和R01/NASS-381重组株病毒致病性的研究取15只4周龄健康SPF鸡随机分为3组，将两株重组病毒分别接种5只，攻毒组通过点眼、滴鼻方式滴加106EID50鸡胚尿囊液0.2mL/只，对照组同种方式接种等量的无菌生理盐水。隔离饲养3天后，全部剖杀取心、肝、脾、肺、肾、脑、气管、胰腺、法氏囊等组织，对照组和接毒组分别做好标记。分别固定于4%多聚甲醛中，通过H.E染色和免疫组化观察各组织病变以及抗原分布情况。结果发现，对照组通过H.E染色后，镜下观察无任何组织病变，免疫组化同样也无任何棕色区域。接种R01/NASS和R01/NASS-381重组株病毒的两个实验组肺脏、肾脏和肝脏均出现病理变化，接种R01/NASS-381重组株病毒的SPF鸡其呼吸道、气管、支气管及肺部淋巴细胞浸润、充血及出血现象比接种R01/NASS重组株病毒的SPF鸡明显。然而其他组织前者都有一定的病变，而后者病理变化极微弱；同样免疫组化结果对比发现，只能在接种R01/NASS-381重组株病毒的SPF鸡的肺脏、肝脏和肾脏中阳性信号明显多于R01/NASS重组株，对照组检测不到任何信号。试验结果表明，两株病毒均有噬肾性，接种R01/NASS-381重组株病毒所引起的组织病理变化比接种R01/NASS重组株病毒严重，可能与NA基因381、313、368和370位氨基酸位点的突变有关。