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前言:
疟疾是由疟原虫感染引起的严重威胁人类生命的感染性疾病之一。最新的统计显示,全世界每年有2.3亿疟疾感染病例,病死人数高达100万。动物模型和人体研究的结果均已表明:CD4+T细胞在抵抗红内期疟原虫感染过程中发挥着至关重要的作用。在疟疾感染过程中,以IFN-γ分泌增加为主的Th1型细胞免疫应答可显著遏制原虫的爆发性增殖,因此诱导有效的抗疟免疫十分重要。
维生素A是最早被发现的维生素,VA作为复杂机体必需的一种营养素,几乎能以不同方式影响机体的一切组织细胞。尽管VA是一种最早发现的维生素,但VA的生理功能至今尚术完全明确。近年来随着对VA的关注,人们发现VA在抗肿瘤、抗感染以及调节免疫等方面的作用越来越显著。同时,有研究表明,补充VA可减少发展中国家感染性疾病的死亡率,同时,在疟疾流行区补充VA,可有效控制疟疾的发展,然而,在非洲的学前儿童中,VA缺乏很普遍,大约32%的儿童受累,共计三千三百万儿童,并且发现,疟疾患者体内,VA的浓度随之降低,然而,目前关于VA在抗疟保护性免疫中的作用及其机制尚不清楚。
我们前期已经成功建立的疟原虫易感的鼠疟模型,实验结果显示:在致死型约氏疟原虫(Plasmosiumyoelii,P.y17XL)感染过程中,BALB～小鼠由于难以建立有效的Thl应答而全部死于感染早期。为此,拟利用我们成功建立的P.y17XL,易感鼠疟模型,观察VA对P.y17XL易感鼠的Th应答影响,以期探讨VA在P.y17XL感染中的作用及其相关机制。旨在为疟疾的有效控制揭示新的理论依据。
实验方法:
1、实验动物、疟原虫及主要试剂
6～8周龄、雌性BALB/c小鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供(许可证编号:SCXK京200420001);P.y17XL(同本爱嫒大学分子寄生虫学教研室惠赠);VA购自Sigma公司(St.Louis,MO,USA)。
2、动物分组与VA处理
BALB/c小鼠随机分为2组:对照组和VA组,每组20只小鼠。P.y17XL感染前连续4天,50mg/Kg体重灌胃大豆油或VA。
3、实验动物感染
BALB/c小鼠分别经腹腔感染1×106P.y17XL寄生的红细胞,感染不同时间小鼠经尾静脉采血,制备薄血膜,Giemsa染色,镜检计数红细胞感染率,并每日观察生存率。
4、脾细胞培养
小鼠感染0d、3d和5d常规无菌摘取脾脏,常规方法制备脾细胞悬液。用含10%FCS的RPMI1640调整脾细胞终浓度至1×107个/ml,24孔培养板(FALCON),每孔加)k500μl细胞悬液,一式3孔,培养48h。350×g室温离心10min,收集上清,-80℃保存,待细胞因子及NO测定。
5、细胞因子检测
双抗体夹心ELISA法对小鼠脾细胞培养上清IFN-γ、IL-10和TNF-α的含量分别进行检测,酶标仪(InterMedNJ-2100)测定450nm处OD值。绘制标准曲线,计算细胞因子含量(pg/ml)。
6、NO水平检测
Griess试剂检测脾细胞培养上清中NO含量,100μl细胞培养上清液和100μlGriess反应液室温反应10min,酶标仪检测550nm处OD值,以NaNO2作为标准品进行浓度换算。
7、流式细胞仪检测小鼠脾脏细胞
FACS检测小鼠感染0d、3d和5d脾细胞中mDCs、pDCs、CD11c+CD86+DCs、CD11c+MHCII+DCs、CD11c+TLR-9+DCs、CD4+T-bet+T、F4/80+CD36+巨噬细胞及Tregs百分数;
8、统计学分析
使用SPSS17.0统计软件对数据进行处理,标本采用独立样本t检验对数据做统计分析。
实验结果:
1、小鼠不同时间原虫血症及其生存率
对照组小鼠感染后3d原虫血症水平开始迅速上升,小鼠于感染后第6d全部死亡。与此相比,VA组小鼠原虫血症上升缓慢,VA明显的降低了原虫血症水平。
2、小鼠感染早期不同时间Thl免疫应答水平
在感染后第5d,VA组小鼠CD4+T-bet+T细胞数量明显降低;脾细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α水平均低于对照组;F4/80+CD36+巨噬细胞数量明显的增加:但是F4/80+巨噬细胞数量没有变化;VA还抑制了NO的水平。
3、小鼠感染早期不同时间DCs的变化
VA组小鼠于感染后第5d不论是mDCs还是pDCs均低于对照组。DCs表面分子CD86和共刺激分子MHCII的表达都明显减少。另外,更加有意义的是,VA明显抑制了DCs胞内TLR9的表达。
4、小鼠感染早期不同时间Treg以及IL-10的动态变化
正常感染小鼠Treg数量在感染后出现明显的升高,但是VA并没有改变这种升高;然而,VA明显促进IL-10的分泌。
结论:
1、VA预处理可降低P.y17XL感染BALB/C小鼠的红细胞感染率;
2、VA预处理可通过抑制DCs的分化和活化影响Thl细胞免疫应答。