论文部分内容阅读
短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1(short palate,lung and nasal epithelium clone 1,SPLUNC1)是特异高表达于呼吸道中的一种分泌蛋白,参与机体免疫防御功能,具有抗感染、清除有害微生物、抑癌、抗肿瘤的作用。SPLUNC1作为一种天然保护性免疫蛋白,对维持上呼吸道的正常生理活动起着重要作用。但目前对SPLUNC1的研究多集中在人和小鼠上,未见绵羊SPLUNC1基因功能研究报导。目的:本实验在成功表达巴什拜羊重组SPLUNC1蛋白(rSPLUNC1)的基础上,对rSPLUNC1进行了蛋白纯化及western blot检测,并进一步研究rSPLUNC1对绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)增殖的影响、对部分病原菌抑菌活性的影响、对中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)活性的调节作用及诱导感染细菌的外周淋巴细胞凋亡的影响,为研究rSPLUNC1的生物学功能奠定基础。方法:(1)rSPLUNC1的纯化及Western blot检测:利用课题组已构建好的巴什拜羊重组巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9K-SPLUNC1阳性克隆株,甲醇诱导表达96h,采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化,Western blot方法检测目的蛋白的表达。(2)rSPLUNC1对Mo增殖的影响:采用平板菌落计数和实时荧光定量PCR两种方法检测3种不同浓度rSPLUNC1(10μg/mL、20μg/m L、40μg/m L)对Mo菌落生长及Mo 16S rRNA增殖的影响。用体视显微镜观察计数单菌落观察菌落生长情况,并利用荧光定量PCR检测Mo 16S rRNA的拷贝数。(3)rSPLUNC1对肺部病原菌的抑菌活性:采用微量稀释法测定不同溶度rSPLUNC1(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml)对巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌4种菌的抑菌活性。在96孔板内将rSPLUNC1与测试菌培养,分别在0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h测定菌液的OD600。(4)rSPLUNC1对NE活性的调节作用:用显色底物法检测3种不同浓度的rSPLUNC1(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml)对NE活性的调节作用。将中性粒细胞与Mo和rSPLUNC1共同培养2h,再于96孔板加入2 mmol/L四肽底物37℃孵育5min后用酶标仪测定OD405nm值。(5)rSPLUNC1对外周淋巴细胞凋亡的影响:将淋巴细胞分别感染Mo、巴氏杆菌、肺炎链球菌3种呼吸道病菌,再加入rSPLUNC1,利用荧光双染法检测淋巴细胞凋亡情况,进一步用琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的DNA Ladder。结果和结论:(1)rSPLUNC1经纯化后,杂蛋白大大减少,SDS-PAGE分析可见蛋白分子量大小为25.53kDa的目的条带;Western Blot检测发现可以与抗His标签的鼠单克隆抗体特异性结合的目的条带,蛋白条带单一,大小为25.53Kda,说明表达的蛋白为目的蛋白。(2)平板菌落计数中,10μg/mL、20μg/mL、40μg/m L rSPLUNC1浓度组菌落数分别比对照组减少37.25%(p<0.01)、48.74%(p<0.01)、67.23%(p<0.01);荧光定量PCR中,自2 h起,实验组Mo 16S rRNA拷贝数降低,4 h时拷贝数最低,10μg/m L、20μg/m L、40μg/mL rSPLUNC1浓度组的拷贝数比对照组降低2.96%(p>0.05)、92.57%(p<0.01)、93.75%(p<0.01)。研究表明,rSPLUNC1对体外培养的Mo具有显著的抑制作用。(3)rSPLUNC1极显著抑制巴氏杆菌、大肠杆菌的生长,在设定浓度内(10-40μg/ml)且呈剂量效应,而对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌的生长没有抑制效果。说明rSPLUNC1能够抑制巴氏杆菌等革兰氏阴性菌。(4)10μg/ml rSPLUNC1显著提高Mo感染的外周中性粒细胞NE的活性(p<0.05),20~40μg/ml rSPLUNC1极显著地提高Mo感染的外周中性粒细胞NE的活性(p<0.01,p<0.01)。说明rSPLUNC1能够调节NE活性,对抗呼吸道感染具有重要意义。(5)采用荧光双染法未见有细胞凋亡的绿色荧光信号,琼脂糖凝胶电泳检测也未见细胞凋亡的特征性DNA Ladder条带。说明SPLUNC1没有诱导感染病原菌的淋巴细胞发生凋亡。