小球藻(Chlorella vulgaris)属于绿藻门(Chlorophyta)绿藻纲(Chlorophyceae)绿球藻目(Chlorococcales)卵囊藻科(Oocystaceae)小球藻属(Chlorella)，是单细胞真核藻类生物。本实验室从南极中山站附近分离纯化到一株小球藻(Chlorella vulgaris)NJ-7，该藻株能在4℃的低温下正常生长，同时也可在20℃的温度下生长。为了探讨其适应低温条件的分子机理，本研究分析了在两种温度下生长的小球藻NJ-7的基因差异表达情况，获得了一批在低温下特异表达基因的全长cDNA和基因组DNA序列，并比较了这些基因在小球藻NJ-7和小球藻的一个温带株UTEX259中的表达模式差异。此外，将小球藻NJ-7的两个抗冻蛋白基因转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中进行了表达。　　 本文的主要研究内容和结果分为三个部分：　　 第一，以小球藻NJ-7为材料，利用抑制性差减杂交技术(SSH)，构建了在4℃和20℃下生长的小球藻NJ-7相互差减的cDNA文库。经过两轮点杂交筛选，共获得20个在4℃特异表达或表达上调的cDNA片段。其中，与已知功能基因具有较高同源性的共有6种，分别是：与小球藻C-27中抗冻基因hiC6和hiC12同源的cDNA片段：与噻唑生物合成酶基因thi同源的cDNA片段；与热激蛋白基因hsp70同源的cDNA片段；与核糖体蛋白基因RPL10A及RPL18同源的cDNA片段。另外，还有14个在4℃特异表达的克隆，在GenBank中未发现与其显著同源的序列。经Northern blot验证，这些基因片段在两种温度条件下的表达水平确实存在着显著的差异。除此之外，还得到了19个在4℃表达下调的cDNA片段。　　 第二，应用RACE技术，获得了5个与已知基因同源的基因全长cDNA序列；通过筛选基因组文库，进一步得到了这些基因的全长基因组DNA序列。分析表明，真核生物基因启动子中普遍存在的调控元件如TATA框、CAAT框等在这些基因上游并未出现，但这些基因的3’-UTR区均有典型的藻类加尾信号TGTAA。通过Northern blot的方法，比较这些基因在小球藻南极株NJ-7和温带株UTEX-259中诱导表达模式的差别，发现它们对低温的响应存在着明显的区别：在温带株中基因受低温诱导很快，而在南极株中受低温诱导极为缓慢。除与已知基因同源的基因外，还获得了4个新基因的cDNA全长序列。　　 第三，将获得的两个抗冻蛋白全长基因NJ7h1C6和NJ7hiC12装置莱茵衣藻rbcL或atpA基因的启动子，构建了4个转基因载体。利用磨珠法分别转入莱茵衣藻cc-849，获得了高效表达外源抗冻蛋白的转化子。　　 本研究得到以下主要结论：　　 (1)在4℃和20℃条件下，小球藻南极株NJ-7的抗冻蛋白基因hiC6和hiC12等存在表达上的显著差异；　　 (2)小球藻NJ-7中基因的调控序列与绝大多数真核生物的基因存在区别，小球藻南极株基因表达对低温诱导的响应比温带株显著减慢；　　 (3)莱茵衣藻可作为一种新型的生物反应器，生产外源抗冻蛋白。