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【背景】家族性高胆固醇血症（FH）是严重的常染色体显性单基因遗传性疾病，其主要特点为血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）水平极度升高，皮肤和肌腱黄色瘤和早发冠心病。FH的主要病理基础是LDLR基因突变，目前为止已报道有1700余种突变，2/3为点突变，1/3为内含子突变、移码突变、大片段插入或缺失等。目前FH的基因诊断传统方法是采用LDLR基因的18个外显子逐个扩增和DNA序列分析的方法，而有可能忽视或未发现隐藏的剪接位点突变和内含子突变。国外报道，直接分析患者全长cDNA序列有可能发现一些常规DNA扩增检测不到的突变。由于受到mRNA取材及测序长度的限制，目前国内尚相关未见报道。本研究参照国外研究成果，结合我国人群LDLR基因特点，建立LDLR基因全长cDNA序列方法，应用于携带剪接位点突变和内含子突变的FH患者，为FH的基因诊断提供新的方法依据。【目的】本研究参考国外研究成果设计两套LDLR基因相互重叠的引物序列，最终选取LDLR基因最适的7对cDNA引物，通过正常人LDLR基因全长cDNA序列扩增，其产物进行拼接后与GenBank比对是否有遗漏，证实本方法的可行性。收集一例传统DNA测序未发现突变的FH纯合患者，抽取其外周血，提取总RNA，逆转录为cDNA，运用LDLR基因全长cDNA序列方法检测出其突变，证实本方法的可靠性，为FH的基因诊断提供新的方法依据。【方法】1．参考国外研究成果设计LDLR基因全长cDNA序列的引物；2．收取正常健康人外周血，试剂盒提取总RNA，逆转录成cDNA；3．采用本室建立的“Touchdown”扩增程序，用已选取的7对cDNA引物进行扩增；4．对扩增产物进行正、反双向核苷酸序列分析，拼接LDLR基因全长cDNA序列；5．将拼接完的cDNA序列与GenBank比对，验证LDLR基因全长cDNA序列是否正确无遗漏；6．根据陈在嘉主编《临床冠心病学》中我国FH临床诊断标准和荷兰的临床监测指南（DLCN），以及FH患者的基因诊断标准从本实验室收集的50例FH患者中选取1例LDLR基因纯合突变的患者为研究对象，进行临床资料，血脂检测、超声心动及心电图等资料的收集；7．用传统的DNA测序方法对此例FH患者进行LDLR基因全外显子逐一扩增。8．将LDLR基因的18个外显子DNA扩增序列与GenBank比对，观察其突变位点；9．抽取此例FH患者外周血，提取其总RNA，逆转录成cDNA；10．将cDNA全长测序方法应用于此例FH患者，采用上述引物扩增、拼接、比对，获得患者突变的类型，以验证此方法的可靠性。【结果】1.参照Tveten等人文献报道中设计的引物进行LDLR基因全长cDNA序列检测，发现不可重复，结合我国人群LDLR基因特点设计合成两套LDLR基因相互重叠的引物序列，根据结果选取了最适的7对全长cDNA序列引物；2.抽取正常人外周血，提取其RNA，总RNA浓度为390ng/μl，A260nm/A280nm吸光度为1.91，说明所提RNA很纯且无降解，符合合成cDNA的要求；3.运用7对cDNA引物扩增正常人LDLR基因全长cDNA，获得7个扩增产物进行测序；4.测序结果显示七个扩增产物序列与GenBank比对均无遗漏，且相互之间交叉重叠；5.7对cDNA引物的扩增产物拼接后再次与GenBank比对，与LDLR基因的2583对碱基完全一致无遗漏。6.收集1例FH纯合患者符合FH纯合子临床诊断，TC为21.2mmol/L，LDL-C为19.7mmol/L，B超显示双侧颈动脉、双侧椎动脉起始段内膜弥漫增厚。7.此FH患者运用传统DNA测序方法逐个扩增LDLR基因的18个外显子，得到的产物进行测序；8.分别将测序结果与GenBank比对，未发现导致FH显性遗传模式基因LDLR和apo B100任何致病性突变。9.抽取此FH患者外周血，提取其RNA，总RNA浓度为410ng/μl，A260nm/A280nm吸光度为1.89，说明所提RNA很纯且无降解，符合合成cDNA的要求；10.运用全长cDNA测序方法检测FH患者第八内含子结合位点剪接突变1187-10，G>A，插入8个单核苷酸。【结论】1.应用设计的7对cDNA引物检测正常人LDLR基因全长cDNA为2581个碱基与标准序列完全一致无遗漏。2.运用传统DNA测序方法检测1例FH患者DNA序列未发现LDLR和apoB100任何致病性突变。3.运用全长cDNA测序方法可检测出剪接位点突变后cDNA长度异常。综上所述，本文参考文献设计的七对cDNA引物应用于正常人LDLR基因cDNA测序，证实全长cDNA测序方法是可行的；并且应用于传统DNA测序方法未检测出突变的FH患者，显示出一个异常剪接，提示第八内含子结合位点剪接突变1187-10，G>A，这个突变激活一个隐藏的剪接位点，插入一个8bp的阅读框，证实此方法可以用于一些临床表现符合FH患者但传统DNA测序方法不能检测出基因突变的例子是可行的。因此cDNA测序方法的建立可为FH的基因诊断提供新的方法依据。