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神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)属于神经内分泌性肿瘤,是儿童期最常见的颅外实体瘤,占婴幼儿恶性肿瘤的首位。随着分子诊断技术的不断发展,精准治疗已逐渐进入NB的治疗范畴,靶向治疗是近年来NB治疗中的一个热门的研究方向。在逐渐提高的诊疗技术的应用中,低危组患者治愈率已超过90%,中危组介于70-90%之间。由于NB具有高度异质性的特点,高危组患者的治愈率仅为40%左右。因此,深入的研究或许可以更透彻的阐明具体的机制并探索新的治疗靶点,为NB未来的诊疗提供一个新的方向。研究表明,很多基因参与NB的发生发展过程,T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1,TIAM1)是其中之一。TIAM1属于GEFs(guanine nucleotide exchange factors)家族成员,是鸟苷酸活性转换重要的调节因子,其在胃癌、肝细胞癌、乳腺癌、肺腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中的蛋白表达异常,但具体作用机制尚不十分明确。本课题主要目的是初步检测TIAM1基因在NB肿瘤组织及细胞中的蛋白表达情况,并结合具体的临床数据,分析TIAM1与NB患者临床病理特征和生存预后的关系,然后通过一系列实验进一步探讨TIAM1在NB发生、发展中的相关作用机制。研究方法:1.二代测序:靶向捕获与NB发生及预后密切相关的基因位点首先制定了包括53个基因全外显子和3个大的基因拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV)区域的NB模板。然后应用此模板对33例NB患者的新鲜肿瘤组织以及配对的外周血白细胞进行靶向深度测序。2.初步研究TIAM1与NB患者临床病理特征和预后的相关性符合入组标准的61例NB患者(具体入组标准见材料与方法),应用免疫组化技术初步检测入组患者的TIAM1表达情况,然后利用SPSS22.0软件分别分析TIAM1表达水平与这些患者各种临床病理特点的关系,最后分析TIAM1表达水平是否影响NB患者的预后生存。3.体外实验:检测TIAM1对NB细胞生物学行为的影响构建TIAM1过表达和降表达的质粒,通过慢病毒感染,建立稳定过表达及稳定降表达TIAM1的NB细胞系,同时建立相应对照组细胞系;利用MTT、平板克隆及划痕实验初步验证TIAM1对NB细胞系增殖、侵袭、迁移能力的影响。4.维甲酸诱导分化实验向NB细胞系SH-SY-5Y及SK-N-Be(2)中加入诱导分化药物维甲酸,在显微镜下每天观察细胞形态的变化,分别在第3、5、7及第9天收集诱导细胞及对照组的蛋白,利用Western blot技术检测细胞中TIAM1蛋白表达含量的变化。5.验证TIAM1参与调节NB分化的细胞信号通路提取稳定过表达TIAM1的NB细胞系及对照组细胞的蛋白质,利用Western blot技术检测细胞中Nestin、NSE、Syn、S100、TrkA及RhoA的蛋白含量变化。结果:1.此33例NB样品组织二代测序数据的质量控制分析发现测序深度极高,大部分样品的靶向捕获率在70%左右,测序结果发现17例体细胞变异,涉及14个基因,TIAM1基因缺失是检测出的新的变异。2.TIAM1的表达强度与NB患者分化程度(χ~2=6.205,P=0.013)密切相关。与年龄(χ~2=0.646,P=0.421)、原发部位(χ~2=0.221,P=0.638)、肿瘤大小(χ~2=1.417,P=0.234)、INSS分期(χ~2=0.033,P=0.856)、危险度分组(χ~2=0.267,P=0.605)、初诊是否转移(χ~2=0.974,P=0.324)以及贫血(χ~2=0.013,P=0.920)等无明显相关性。TIAM1的表达强度对NB患者3年总体生存率(OS,χ~2=0.158,P=0.691)及无进展生存率(PFS,χ~2=0.131,P=0.717)亦无明显相关性。3.与对照组细胞系相比,NB细胞系经TIAM1过表达后,细胞增殖能力增高,侵袭、迁移能力下降,但变化的程度均未达到统计学差异。4.与对照组细胞相比,维甲酸诱导分化后的NB细胞系中TIAM1蛋白表达量显著增加。5.稳定过表达TIAM1的NB细胞系中NSE、Syn、S100的蛋白表达量显著增加,而神经干细胞标志物Nestin蛋白含量明显降低。TrkA/TIAM1/Rac1及P75NGFR/RhoA信号通路中关键蛋白RhoA及TrkA的蛋白含量明显降低。结论:1.TIAM1蛋白在节细胞神经瘤中的表达量明显高于节细胞NB及NB,提示TIAM1可促进NB组织的分化。2.体外实验证实,TIAM1对NB细胞增殖、侵袭和迁移能力无明显相关性。3.TIAM1可通过TrkA/TIAM1/Rac1信号通路调节NB组织的分化过程。