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果蝇PINTA蛋白具有CRALTRIO结构域,可以同类视黄醇物质如视黄醛、视黄酸等维生素A的衍生物结合。已有研究结果显示,PINTA蛋白的功能与视觉形成有关,在果蝇视网膜色素细胞中起作用。PINTA结合全反式视黄醇是形成视紫红质所必需的一条途径,pinta基因的缺失会导致果蝇感光细胞受损,从而影响果蝇视觉。家蚕基因组中pinta同源基因目前尚未有文献报道。本研究通过生物信息学分析和克隆测序在家蚕基因组中筛选出可能具有与果蝇pinta同源基因相似功能的4个基因作为家蚕pinta的候选基因,并对其进行了时空表达模式检测和原核表达,并获得可溶性蛋白质,同时在体外进行了PINTA同源蛋白同类视黄醇类物质的结合能力检测,为进一步明确pinta同源基因在家蚕中的生物学功能和类胡萝卜素代谢途径在家蚕中的作用提供依据。主要研究结果如下:1.家蚕pinta同源基因的鉴定利用已报道的果蝇PINTA蛋白序列,在家蚕基因组数据中进行比对检索,鉴定出25个家蚕具有CRAL-TRIO结构域的同源基因,根据其在NCBI中的注释和预测,我们选择了其中被预测为可能具有与果蝇pinta同源基因相似功能的4个基因作为家蚕pinta的候选基因,将其分别命名为pinta1、pinta2、pinta3和pinta4。4个家蚕pinta同源基因一共编码6种蛋白质,在这6种蛋白中,PINTA1和pinta2编码的三个蛋白质序列相似性很高,PINTA1与PINTA2X1相似性高达93%,PINTA1与PINTA2X2和PINTA1与PINTA2X3相似性均为75%;PINTA2和PINTA3氨基酸序列相似性也较高,为47%。但PINTA4和另外几种PINTA蛋白质之间氨基酸序列差异较大,PINTA2和PINTA4有20%的氨基酸序列相似性。此外,生物信息学分析发现,家蚕PINTA同源蛋白6种蛋白全部为外在膜蛋白,不含跨膜结构,且6种蛋白均未预测到信号肽序列,6种蛋白均含有CRALTRIO结构域。2.家蚕pinta1、pinta2、pinta3和pinta4同源基因的时空表达模式检测使用RT-PCR和qPCR对所鉴定出的4个pinta同源基因在家蚕大造品系不同时期和五龄三天各组织中的表达模式进行了检测,结果显示:家蚕pinta四个同源基因在家蚕大造品系整个发育时期都有表达,pinta2基因中的pinta2x1的表达丰度最高,pinta2x1在家蚕整个发育时期都高量表达;pinta3和pinta4的表达丰度次之,pinta3和pinta4表达情况相似,均在家蚕幼虫发育时期高量表达;而pinta1x2、pinta2x2和pinta2x3在家蚕整个发育时期微弱表达。在家蚕大造品系五龄三天不同组织中,pinta2x1的表达丰度最高,在各组织中均有高量表达,且在卵巢的表达量最高,在中肠和丝腺表达量次之。pinta3在体壁、中肠、头和脂肪都有高量表达。pinta4在头和中肠有高量表达。3.家蚕pinta2x1、pinta3和pinta4基因的原核表达、蛋白质纯化、抗体制备及免疫印迹检测克隆家蚕pinta2x1、pinta3和pinta4全长CDS序列,成功构建了插入正确序列的p ET-28apinta2x1、p ET-28apinta3和p ET-28apinta4重组质粒,将重组质粒导入表达菌株进行原核表达,在0.5 m M IPTG,16℃和20 h的条件下,在上清中成功诱导表达出PINTA2X1、PINTA3和PINTA4三个可溶性蛋白。将含有可溶性蛋白的上清溶液通过Ni-NTA柱纯化,纯化出PINTA2X1、PINTA3和PINTA4三个蛋白。将纯化好的PINTA4进行多克隆抗体制备,抗体制备好后进行家蚕大造品系不同时期和五龄三天各组织中的WB实验,结果显示:PINTA4蛋白在家蚕不同发育时期均有表达,在家蚕蛾卵发育时期表达水平较高,幼虫期逐渐降低,在熟蚕期表达量又逐渐升高。在家蚕大造五龄三天组织中,PINTA4在头,体壁,中肠和脂肪中的表达量较高,其中在中肠的表达量最高,在卵巢,血和丝腺中的表达量偏弱,在精巢中没有检测到表达。这一结果同前面m RNA水平的检测结果基本一致。4.PINTA4抗体在家蚕蛾期复眼的免疫组化分析制做家蚕蛾期复眼的HE染色组织切片来观察其内部结构组成,通过与文献中其他昆虫的复眼结构图比较,了解家蚕蛾期复眼的结构组成。随后用PINTA4抗体对其进行免疫组化实验处理,研究结果显示:PINTA4的分布与果蝇的有差别,果蝇PINTA主要分布在色素细胞中,而家蚕PINTA4抗体经与对照对比,并未在色素细胞中发生反应沉淀,也未发现在视网膜其他区域有沉淀发生。5.家蚕PINTA2X1、PINTA3和PINTA4与类视黄醇物质的荧光竞争结合能力检测利用原核表达纯化出来的PINTA2X1、PINTA3和PINTA4与荧光试剂1,8-ANS结合形成复合物后,再添加类视黄醇物质（全反式视黄醇,全反式视黄醛,全反式视黄酸,11-顺式视黄醛,9-顺式视黄酸）进行竞争结合实验,探索纯化的三种PINTA蛋白与视黄醇及其衍生物的亲和力大小。实验结果显示:PINTA2X1蛋白与全反式视黄酸的亲和力是最强的,与全反式视黄醛的亲和力次之,与PINTA蛋白亲和力最弱的是全反式视黄醇。PINTA3和PINTA4与类视黄醇物质的结合情况与PINTA2X1基本相同。