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背景妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）是妊娠中晚期特有的肝脏疾病。其发病有种族与地域的差异。ICP最主要的后果是对胎儿产生的危害，如围产儿死亡、胎儿宫内窘迫、早产、新生儿窒息、羊水胎粪污染等。ICP发病机理尚不明确，具有家族性、复发性特点。ICP目前还无公认的统一的诊断和分度标准。临床在治疗ICP时面临两难的境地。如果漏诊（重度漏诊为轻度ICP），则很有可能发生“难以预料的胎儿宫内死亡”；如果发生误诊（轻度误诊为重度ICP），则使剖宫产的发生率上升和治疗性早产的增加，导致一些没有必要的医疗费用的增高、以及医疗资源的不合理浪费等现象。实验室检查在ICP的诊断中起着不可或缺的作用。血清中总胆汁酸的检测是诊断ICP的十分重要的指标，但仅仅血清胆汁酸指标仍不够特异和灵敏，也受到其他诸多因素的影响。众多学者研究了血清胆汁酸代谢产物对ICP的诊断应用价值，虽然给临床提供了一定的有价值的信息，但至今仍缺乏公认的能有效进行ICP诊断和鉴别诊断的检测指标。尿硫酸化的胆汁酸是胆汁酸的主要清除形式，特别是在肝胆疾病的情况下。蓄积体内的胆汁酸硫酸化后水溶性增加，更易于被肾脏清除，从而减少高浓度非硫酸化胆汁酸所造成的肝脏损伤。ICP病人主要特征是肝内胆汁淤积，因而，检测尿中硫酸化胆汁酸可能对ICP的诊断和分度具有重要的价值。近年来发展起来的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测灵敏度高，特异性好，是检测尿硫酸化胆汁酸的理想方法，使全面了解ICP患者尿液硫酸化胆汁酸组分的变化成为可能。目的采用液相色谱-串联质谱法，对三类人群（正常孕妇、轻度ICP与重度ICP患者）的尿硫酸化胆汁酸进行代谢轮廓分析。研究三类人群尿硫酸化胆汁酸代谢轮廓、血清生化指标的变化情况，寻找潜在的有价值的可用于ICP诊断和分度的尿硫酸化胆汁酸标志物，为临床对ICP进行正确诊断和分度提供依据。方法1.液相色谱-串联质谱检测尿硫酸化胆汁酸方法学研究通过硫酸化石胆酸（3S-LCA）、硫酸化牛磺石胆酸（3S-TLCA）和硫酸化甘氨石胆酸（3S-GLCA）三种硫酸化胆汁酸标准品质谱条件的优化，探索硫酸化胆汁酸的最佳离子化参数。根据硫酸化胆汁酸的性质选择合适的流动相、色谱柱，并测试不同条件下的梯度洗脱方式，探索最佳的色谱条件。考察不同条件下的尿液样品处理方式，探索和优化尿液样品的处理条件。在已优化的色谱、质谱及样品处理条件基础上，研究和探索检测尿中硫酸化胆汁酸的最佳质谱条件，并通过回收试验、精密度试验、灵敏度、检测线性等评估所建立的方法学的性能。2.ICP病人尿硫酸化胆汁酸代谢轮廓分析根据现有的ICP病人诊断与分度标准，收取18例正常孕妇、20例轻度ICP病人、23例重度ICP病人尿液标本。使用LC-MS/MS检测三类人群（正常孕妇、轻度ICP、重度ICP）的尿硫酸化胆汁酸，通过代谢轮廓分析的方法，寻找对ICP诊断和分度有潜在价值的尿硫酸化胆汁酸标志物。结果1.建立了HPLC-MS/MS分析尿硫酸化胆汁酸代谢轮廓的方法。样品采用OASIS HLB柱固相萃取,经luna C18（150mm×2.00mm，3μm）色谱柱分离，柱温40℃，流动相组成为：A为含0.1%甲酸和2mmol/L乙酸铵甲醇溶液；B为含0.1%甲酸和2mmol/L乙酸铵乙腈溶液，流速0.2ml/min，梯度洗脱，使用电喷雾离子源(ESI)，负离子模式，多反应监测模式(MRM)检测。2.每个样本的分析时间为18min。3S-TLCA、3S-LCA及3S-GLCA线性范围分别为9.7-998.0ng/ml，9.0-1080.0ng/ml，9.3-1123.3ng/ml，相关系数达到0.999。3S-LCA,3S-GLCA和3S-TLCA的检测限均为5ng/ml。日内精密度均小于4.0%，日间精密度均小于5.0%。三种硫酸化胆汁酸的回收率在89.4-100.7%范围内。3.血清中甘胆酸（CG）、总胆汁酸（TBA）、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）在轻度ICP和重度ICP均较正常孕妇显著升高。碱性磷酸酶（ALP）在三个组均升高，但无显著差别。直接胆红素（DBIL）和总胆红素（TBIL）在重度ICP组比正常孕妇组显著升高。4.与正常孕妇相比，总硫酸化胆汁酸在轻度和重度ICP组分别增高4.0倍（p＜0.017）和9.0倍（p＜0.017）。其中硫酸化甘氨结合型胆汁酸（Total3S-Glyco BA）和硫酸化牛磺结合型胆汁酸（Total3S-TauroBA），分别增加3.2倍和4.5倍（轻度ICP组），11.6倍和23.2倍（p＜0.017,重度ICP组）。3S-Tauro BA/3S-Glyco BA在正常孕妇组、轻度ICP组和重度ICP组分别为44.8%、62.1%和89.5%。与其他硫酸化胆汁酸相比，硫酸化未结合胆汁酸在正常孕妇组、轻度ICP组和重度ICP组的含量均较低。3S-LCA在所有硫酸化胆汁酸中含量最少。在尿各种硫酸化胆汁酸中，甘氨结合型及牛磺酸结合型的硫酸化胆汁酸是最主要的成份，占总硫酸化胆汁酸的90%以上。尿中3S-GCA,3S-TCA,3S-CA,3S-TLCA和3S-TDCA/3S-TCDCA/3S-TUDCA在重度ICP组较正常孕妇组显著升高。5.主成份分析（PCA）表明重度ICP和正常孕妇能够区分开，而轻度ICP基本上和重度ICP及正常孕妇分开。通过偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，用该模型诊断正常孕妇的正确率为88.9%，诊断重度ICP的正确率为90.0%。结论本研究建立了HPLC-MS/MS分析尿硫酸化胆汁酸的检测方法。并通过增强型子离子扫描（EPI）质谱分析，成功地鉴定了尿中15种可能的硫酸化胆汁酸。通过对尿硫酸化胆汁酸代谢轮廓分析，重度ICP组能与正常孕妇组较好地区分开，而且识别了二例无症状高胆汁酸孕妇（AHP）。通过偏最小二乘法中变量的权重分析，发现了诊断重度ICP有重要价值的硫酸化胆汁酸代谢物。