一、研究背景蜱媒病是一种由蜱传播的人兽共患病,蜱传病原体包括立克次体、无形体、埃立克体、疏螺旋体、巴贝西虫和病毒等。随着分子生物学技术的不断发展,许多包括新种、新株或者新基因型在内的蜱传病原体在世界范围内被发现,引起医务人员的普遍关注。蜱的生活周期包括卵、幼虫、若虫和成虫四个阶段,有的病原体可以经期传播到蜱的不同发育阶段,某些病原体例如立克次体还可以通过经卵传播至下一代,每一个阶段的蜱都可以叮咬不同的宿主动物,增加了蜱传病原体的传播危害,其整个生活史持续时间较长,每一个阶段的虫体无需吸血也可以存活很长时间,这就给病原体提供了一个稳定的生存环境,因此蜱不仅是病原体的传播载体,也是一个优良的宿主。病原体之有蜱,犹鱼之有水,为了防止蜱媒病在全球范围内愈演愈烈的趋势,蜱媒病的监测治疗及病原体的致病机制研究显得尤为重要。本研究我们将蜱传病原体分为三类,分别是国外已有报道可以使人致病,同时我们课题组在国内也证实了可以感染人的病原体:国外已有报道可以使人致病,但是国内尚无病人监测研究的病原体;国内外全新的蜱传病原体。蜱传病原体致病机制研究是防控和治疗蜱媒病的关键,但是目前国内在蜱传病原体分离方面的研究较少,这就使病原体致病机制研究很难开展,尤其是胞内寄生的斑点热群立克次体和病毒,很难在体外通过细胞培养分离到。由于我国各地生境复杂,蜱种丰富,宿主多样,蜱媒传染病公共卫生危害大,开展蜱传病原体的体外细胞分离具有重要的生物学和卫生学意义。目前,国内研究较多的蜱媒病有蜱传斑点热、巴贝西虫病和发热伴血小板减少综合征等,其中蜱传斑点热的病原体研究比较透彻,国内总共有四种斑点热群立克次体可以感染人,分别是黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangiensis)、新塔拉萨维奇立克次体(Candidatus R.tarasevichiae)、拉欧蒂立克次体(R.raoultii)和西伯利亚立克次体(R.sibirica)。在国内由疏螺旋体引发的蜱媒病主要是莱姆病,其病原体为伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu lato)。近期国外报道了一种新发蜱媒病,由米亚莫托疏螺旋体(B.miyamotoi)引发,人感染之后临床症状主要包括发热、疲劳、头痛等,但是目前我国没有报道相关病例。由于我国东北地区林木资源丰富,生态环境好,蜱种及各种宿主动物多样,是重要的蜱媒病自然疫源地。于是我们利用当地的蜱媒病哨点医院(牡丹江林业中心医院)对新发米亚莫托疏螺旋体感染情况开展了调查,以了解其对当地人群构成的威胁。二、研究目的本研究旨在利用蜱的标本对蜱传病原体进行体外细胞分离,为蜱传病原体的致病机制研究奠定基础。同时本研究以牡丹江林业中心医院为哨点医院开展人感染米亚莫托疏螺旋体的监测,并调查当地蜱中米亚莫托疏螺旋体的流行情况,评估其对公共卫生健康的危害。三、研究方法在我国东北、云南和广西等地用布旗法采集游离蜱,然后利用细胞培养技术对斑点热群立克次体或蜱传病毒阳性蜱接种分离蜱传病原体。对于成功分离到的病原体进行分子生物学和形态学鉴定,分析其进化地位,描述其形态特征。对于已知对人致病的蜱传病原体,开展哨点医院监测研究,以近两个月内有蜱叮咬史为病例纳入标准,于2013-2015年每年的5月-7月收集病人样本和流行病学及临床信息,同时在病人居住地附近采集游离蜱。对于阳性标本,扩增病原体特异的片段,分析其进化地位,描述病例流行病学信息及临床表现特征。对于对人致病性不明的病原体,主要研究其与宿主蜱之间的相互关系,在实验室条件观察其对蜱的感染及在蜱器官中的分布,蜱主要抗感染通路关键因子与病原体的相关关系等。四、研究结果利用Vero细胞从东北的森林革蜱中分离到一株拉欧蒂立克次体(R.raoultii),通过吉姆萨染色和超薄切片显微镜观察发现其形态为球形或短杆状,长在1.0um-2.6 um之间,宽在0.2 um-0.4 um之间,是典型的立克次体结构。通过系统进化树发现,该株拉欧蒂立克次体与其它已报道拉欧蒂立克次体进化地位一致。在984份蜱咬病人中,结合PCR检测结果和临床特征确诊了14例米亚莫托疏螺旋体病人;在692只游离蜱中,19只全沟硬蜱(Ixodid persulcatus)和1只嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)为米亚莫托疏螺旋体PCR阳性。根据系统进化树结果发现,米亚莫托疏螺旋体可以分为三个基因型,分别为西伯利亚型、欧洲型和美国型,本研究的米亚莫托疏螺旋体序列与包括俄罗斯和日本在内的西伯利亚型相似,而与欧洲型和美国型在进化上有差别。14例病人临床症状及实验室指标分析发现,感染米亚莫托疏螺旋体的患者均具有流感样症状,其中6例(42.9%)患者伴有发热,体温从38.4℃到39.7℃不等,6例(42.9%)患者头痛,5例(35.7%)患者厌食,3例(21.4%)患者关节疼痛。各有1例(7.1%)患者具有皮疹、焦痂和局部淋巴结肿大症状。通过血常规和血生化检查发现,有2例(14.3%)患者白细胞计数升高,1例(7.1%)患者血小板降低,2例(14.3%)患者丙氨酸转氨酶和谷草转氨酶均有升高。14例患者中有4例患者因为高烧(38.4℃-39.7℃)住院,住院时长从3天到20天不等。其中两例住院患者使用多西环素治疗,每天两次,一次100 mg。在使用多西环素治疗3-5天后,患者体温恢复正常,其他症状随之消失。住院病例没有死亡,在随访调查中也没有后遗症发生。有2例患者复合感染了新塔拉萨维奇立克次体,1例患者复合感染了山羊无形体(Anaplasma capra),但是同其他11例患者比较,3例复合感染的患者在临床上并没有更复杂严重的症状,病期也没有延长。利用蜱细胞系BME/CTVM23细胞从来自广西马来穿山甲身上的爪哇花蜱(Amblyomma javanense)分离到一株新发病毒,命名为广西蜱病毒(Guang Xi tick virus,GXTV),为单链正义RNA病毒,并且获得了其全基因组序列,经比对发现,GXTV与之前发现的一株名为荆门蜱病毒(JMTV)的病毒相似,整体相似性为93.8%,且同为分节段病毒,基因组分为四个节段。GXTV与JMTV都具有特殊的进化地位,它们的两个节段与不分节段的黄病毒科进化关系最近,而另二个节段至今没有发现有类似的病毒序列。具有同样特点的还有一株从蚊子分离到的瓜伊科库蚊病毒(Guaico Culex virus,GCXV),然而不一样的是,我们证实GXTV是不分颗粒在同一个细胞里共同复制四个节段的病毒,而GCXV是分颗粒病毒(multicomponent virus)。另外,实验室条件下,GXTV可以通过浸泡法感染爪哇花蜱成蜱和微小扇头蜱(Rhipicephalus(Boophilus)microplus)幼蜱,而无法感染长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)成蜱和血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguinensis)若蜱。通过原位荧光杂交实验(FISH)证实,在实验室条件下,GXTV可以在蜱唾液腺中高效复制,但是从中肠转移到唾液腺需要约14天。与抗病毒有关的RNA干扰(RNAi)通路中的Dicer和Argonatue的mRNA水平在病毒体外感染蜱细胞的过程中被显著抑制。五、研究结论用Vero细胞从我国东北的森林革蜱分离到一株拉欧蒂立克次体,明确了其进化地位。在我国东北地区发现了人感染米亚莫托疏螺旋体的病例,对其临床特征及治疗情况进行了描述,发病后主要症状包括发热、疲劳、头痛、寒颤、肌痛、关节痛和恶心等,可使用多西环素对病人治疗。同时在当地蜱中也检测到了米亚莫托疏螺旋体,确认了东北地区是米亚莫托疏螺旋体的自然疫源地。用蜱细胞系BME/CTVM23细胞从广西马来穿山甲来源的爪哇花蜱中分离到一株新发病毒,将其命名为GXTV,获得了其全基因组序列,证实了其在爪哇花蜱和微小扇头蜱中的感染,明确了其在爪哇花蜱唾液腺和中肠的分布情况,与GCXV和黄病毒相比,其在病毒复制,感染及与蜱宿主互作上都呈现不同的特点。六、意义与创新性本研究首次在国内通过Vero细胞从蜱中分离到一株R.raoultii,相比之前报道中的分离株,该株R.roultii可以稳定传代,对以后开展立克次体致病机制的研究提供了基础。首次在我国报道了米亚莫托疏螺旋体感染人的病例,并在蜱中检测到该疏螺旋体,结合人感染米亚莫托疏螺旋体的临床特征和治疗方法,对米亚莫托疏螺旋体的诊断提供了重要依据,填补了国内关于米亚莫托疏螺旋体流行病调查的空白。本研究用蜱细胞系BME/CTVM23分离到一株新发蜱传病毒,丰富了新发蜱传病毒种类,在未发现其可以感染人之前对其基本特征进行了初步研究,为评价其致病性及了解进化规律与蜱相互作用等方面提供了基础。