缺氧预处理对大鼠视网膜缺血再灌注的保护作用的研究前言缺氧预处理(hypoxia preconditioning，HPC)是指一次或多次短暂的非致死性的低氧刺激后，机体获得的对更严重甚至致死性缺血缺氧的耐受性。作为机体抵抗缺血／再灌注损伤的内源性保护现象，缺氧预处理保护作用包括HPC后即刻出现并持续1-3h的早期保护和12-24h再度出现、持续1-3d的延迟保护两个时相，存在于细胞水平。我们通过制备大鼠缺氧预处理及视网膜缺血再灌注模型，探讨缺氧预处理对大鼠视网膜缺血再灌注的影响。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factorl，HIF-1)是在研究缺氧诱导的红细胞生成素(EP0)基因表达时被发现的。它是缺氧诱导细胞所产生的一种蛋白质，由1个120ku的α亚基和1个91-94ku的β亚基组成的异源二聚体，前者在缺氧时上调，后者为结构性表达，主要是HIF-1α参与缺氧时应激反应。缺氧预处理的保护机制尚未完全阐明，大量的研究表明，其延迟保护作用与细胞内信号转导途径介导的内源性保护蛋白质的合成有关。本实验在研究HIF-1α在视网膜缺血再灌注中的表达及作用的基础上研究缺氧预处理对视网膜缺血再灌注的保护作用，并探讨HIF-1α在此过程中的表达及作用。目的一、第一部分研究低氧情况下视网膜细胞内HIF-1α及p53的蛋白表达及HIF-1α与p53表达的关系。二、第二部分探讨大鼠视网膜缺血再灌注损伤中HIF-1α的表达，视网膜细胞凋亡的发生，以及二者之间的关系，以期为临床疾病的治疗提供理论依据。三、第三部分通过制备大鼠缺氧预处理及视网膜缺血再灌注模型，探讨缺氧预处理对大鼠视网膜缺血再灌注的影响。并探讨HIF-1α在缺氧预处理对大鼠视网膜缺血再灌注过程中的作用及意义。四、第四部分探讨PI-3K信号途径在大鼠视网膜缺氧预处理后缺血再灌注过程中对HIF-1α表达影响及意义。方法一、第一部分常压低氧动物模型：有机玻璃制成低氧仓，体积100cm×60cm×60cm。有机玻璃厚4cm，三氯甲烷封侧面，以便开仓取换食物、水及取鼠。在氧仓的上面开一直径1cm的出气孔，侧面开一直径1cm的进气孔。通过三通管分别接氮气和压缩空气。用玻璃转子流量计(沈阳市北量流量仪器厂)控制流量。分组：56只大鼠随机分为2组，每组各28只，分别饲养于常氧环境及50ml／l低氧仓。于饲养后0、2、6、8、12、24、48h各处死4只，分别进行光镜，电镜观察，免疫组化测定HIF-1α及P53表达，图像分析测定HIF-1α阳性细胞平均积分光密度值和P53阳性细胞平均积分光密度值。RT-PCR检测：分别于不同时间点取材检测。所有数据采用x±s表示，应用SPSS13.0软件包进行数据处理。二、第二部分视网膜缺血再灌注模型的制作：取大鼠经腹腔注射20％水合氯醛(3毫升每1000克体重)，全身麻醉后地卡因点眼表面麻醉2次。将大鼠头部固定于实验台上，以4号半注射针头自大鼠颞侧角膜缘穿刺入前房固定，针头远端连接于生理盐水瓶，穿刺后慢慢升高输液瓶至与动物垂直距离为150cm处，于此高度在大鼠眼内形成110mmHg(1kPa=7.5mmHg)的眼压，维持此高眼压状态60min。分组：随机分为3组，A组：正常对照组6只；B组：缺血再灌注组42只。每只大鼠任选一眼进行前房灌注，根据再灌注时间不同分为0、2、6、8、12、24、48h，共7小组，每小组各6只；C组：随机选取6只大鼠任意眼进行前房穿刺，作为实验对照组(假手术组)。行HE染色、免疫组织化学染色及TUNEL染色，图像分析测定HIF-1α阳性细胞平均积分光密度值和凋亡阳性细胞平均积分光密度值。透射电镜检查，并行RT-PCR检测。所有数据采用x±s表示，应用SPSS13.0软件包进行数据处理。三、第三部分随机分为2组，A组：缺氧预处理组54只，再随机分为2个亚组，视网膜缺血再灌注(手术组)42只和前房插入输液器不进行灌注(假手术组)6只；B组：常氧组48只。再随机分为2个亚组，手术组42只和假手术组6只。A组动物饲养于5％常压低氧仓内4小时后取出后常氧饲养24小时，分别进行视网膜缺血再灌注及假手术处理。B组动物常氧饲养28小时后分别进行视网膜缺血再灌注及假手术处理。大鼠视网膜缺血再灌注的方法：同第二部分。假手术的方法：经腹腔注射20％水合氯醛(3毫升每1000克体重)，全身麻醉后地卡因点眼表面麻醉2次。将大鼠头部固定，以4号半注射针头自大鼠颞侧角膜缘穿刺入前房固定，针头远端卡住，无液体进入前房，维持此状态60min。分别于处理后0、2、6、8、12、24、48h随机处死大鼠进行免疫组化检测，细胞原位凋亡检测，RT-PCR检测，电镜检测。所有数据采用x±s表示，应用SPSS13.0软件包进行数据处理。四、第四部分随机分为3组，A组：Wortmannin处理组42只，B组：对照组42只，C组：空白对照组6只，眼别任选，并标记。对照组玻璃体内注射平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)0.01毫升，Wortmannin处理组玻璃体内注射Wortmannin0.01毫升，浓度为20nmol／l(如有玻璃体出血则去除，另选大鼠替补)，进行缺氧预处理4h，取出。24h后对进行玻璃体处理的那只眼行前房灌注，1h后于不同时间点取材分别行免疫组化及RT-PCR检测。空白对照组不进行处理。视网膜缺血再灌注模型的制作：同第二部分。标本采集与检测分别于前房灌注后的相应时间点过量麻醉药处死大鼠，大鼠处死后行HE染色、免疫组织化学染色，图像分析测定HIF-1α阳性细胞平均积分光密度值。RT-PCR检测：分别于不同时间点取材检测。所有数据采用x±s表示，应用SPSS13.0软件包进行数据处理。结果一、第一部分常氧条件下各时间点HIF-1α及P53的表达极为微弱，缺氧条件下HIF-1α及P53表达呈曲线变化：缺氧2h即出现HIF-1α表达，随着时间延长表达逐渐增加。8h基本达到高峰，12h至24h持续强表达，48h表达明显下降。缺氧6h即出现P53表达，随着时间延长表达逐渐增加，8h明显表达增强，24h基本达到高峰，以后下降。两者表达成正相关。二、第二部分正常对照组、实验对照组均未见到HIF-1α阳性表达，缺血再灌注2、6、8、12、24、48h组均见到HIF-1α阳性表达，缺血再灌注12h组阳性表达至高峰；缺血再灌注12、24、48h组，视网膜神经节细胞层(GCL)及内核层(INL)可见HIF-1α的阳性表达。视网膜缺血60min再灌注12、24h后，视网膜的GCL和INL可见大量TUNEL的阳性细胞，但48h后阳性细胞少见。正常对照组、实验对照组及缺血再灌注0，2h组均未见到凋亡阳性细胞，缺血再灌注12、24、48h组视网膜神经节细胞层及内核层可见凋亡阳性细胞的表达。透射电镜下对照组未见明显异常，各层组织区分明显，结构清楚。随着缺血再灌注时间延长，神经节细胞变性加重，线粒体明显膨胀，滑面内质网扩张，粗面内质网脱颗粒，核仁靠近核膜，神经纤维层轴突水肿加重，结构疏松。缺血60min再灌注12、24h后，大鼠视网膜的GCL和INL可见细胞核浓缩，GCL明显变薄。缺血60min再灌注24h后还偶见空泡状细胞。缺血60min再灌注48h后，可见INL也显著变薄，可见凋亡小体，部分内核层细胞皱缩，核固缩，染色质浓缩呈分叶状结构。RT-PCR结果。12h HIF-1α／β-actin达到最高值。与免疫组化的结果一致。三、第三部分1、光镜下表现24hHPC组：视网膜结构清晰，仅有轻度水肿，未见神经节细胞改变：24h R／P组：视网膜内层肿胀，神经节细胞水肿，神经节细胞核疏松，胞质可见空泡。2、免疫组化假手术组大鼠视网膜中均未能检测到HIF-1α的表达。在缺血再灌注6h开始有HIF-1α的表达，并逐渐加强，至12h达到最强，24h开始减弱，48h仍可见到HIF-1α的表达，其中12h组与其余各组比较，差异有显著性。缺氧预处理后缺血再灌注2、6、8、12、24、48h组均见到HIF-1α阳性表达，8h组阳性表达至高峰，HIF-1α的表达明显高于无缺氧预处理组。经统计学处理，各期HIF-1α吸光度与对照组比差异有显著性。在缺血再灌注组中各期视网膜HIF-1α平均积分光密度最大值为缺血再灌注12h组，缺氧预处理各期视网膜HIF-1α平均光密度最大值为8h组。两组比较T=2.985，p=0.031＜0.05差别有显著意义。正常对照组、实验对照组及缺血再灌注2、6h组均未见到凋亡阳性细胞，与缺血再灌注12、24、48h组比较均有显著性差异(P＜0.05)；缺血再灌注12、24、48h组视网膜神经节细胞层及内核层可见凋亡阳性细胞的表达；缺氧预处理后缺血再灌注12、24、48h组均见到凋亡阳性细胞，但较无缺氧预处理组明显减少，TUNEL平均光密度最大值为24h组，两组比较T=3.443，p=0.018＜0.05且峰值不明显。两组比较有显著差异。3、透射电镜观察对照组未见明显异常，透射电镜下各层组织区分明显，随着缺血再灌注时间延长，神经节细胞变性加重，线粒体明显膨胀，滑面内质网扩张，粗面内质网脱颗粒，核仁靠近核膜，细胞有损伤的变化。缺血60min再灌注12、24h后，大鼠视网膜的GCL和INL可见细胞核固缩或浓缩，GCL明显变薄。缺血60min再灌注24h后还偶见空泡状细胞。缺血60min再灌注48h后，可见INL也显著变薄。细胞凋亡与视网膜内核层部分细胞核染色质边集的现象明显，可见凋亡小体，部分内核层细胞皱缩，核固缩，染色质浓缩呈分叶状结构。4、RT-PCR检测进行与未进行缺氧预处理组视网膜缺血再灌注不同时间点视网膜HIF-1αmRNA的表达。视网膜缺血再灌注后从6h组开始视网膜HIF-1αmRNA有表达，以后逐渐增强，12h达到最高，以后降低。0h，及对照组无HIF-1αmRNA表达。缺氧预处理视网膜缺血再灌注后从2h组开始视网膜HIF-1αmRNA有表达，以后逐渐增强，8h达到最高，以后降低。0h及对照组无HIF-1αmRNA表达，RT-PCR检测结果同免疫组化的结果相一致。四、第四部分缺氧预处理组视网膜缺血再灌注2、6、8、12、24、48h组均见到HIF-1α阳性表达，缺氧预处理组视网膜缺血再灌注12h组阳性表达至高峰于12、24、48h组，视网膜神经节细胞层及内核层可见HIF-1α的阳性表达。Wortmannin处理组HIF-1α的阳性表达明显降低，且峰值不明显，主要在8、12、24h表达，亦在12h达到高峰，然后逐渐降低。与对照组HIF-1α(IOD)比较T=13.46P＜0.01两组比较结果有显著差异。结论一、第一部分常氧条件下各时间点HIF-1α及P53的表达极为微弱，缺氧条件下HIF-1α及P53表达呈曲线变化，HIF-1α和P53表达呈正相关。二、第二部分视网膜缺血再灌注hif-1α的阳性表达同视网膜TUNEL阳性细胞成正相关。三、第三部分缺氧预处理对视网膜缺血再灌注损伤具有保护作用，HIF-1α在此过程中与凋亡成负相关，在缺氧预处理对视网膜缺血再灌注损伤具有保护作用过程中HIF-1α起着重要的作用。四、第四部分PI-3K特异抑制剂Wortmannin(WT)使缺氧预处理对视网膜缺血再灌注损伤的大鼠视网膜HIF-1α表达明显减弱。说明缺氧预处理缺血再灌注的大鼠视网膜HIF-1α表达是通过PI-3K途径来实现的。