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研究背景：树突状细胞(dendritic cells, DCs)是免疫稳态的调节细胞,可以激活初始T细胞。可以诱导自身免疫耐受的DCs叫作耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells. tDCs)。tDCs低表达MHC Ⅱ分子和共刺激分子,并在自身免疫病中发挥强有力的免疫调控能力。免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia, ITP)是一种临床常见的出血性疾病,以免疫介导的血小板破坏和／或血小板生成抑制为主要特点。其主要的发病机制是识别自身血小板抗原的自身反应性T细胞被激活,导致对自身血小板抗原的免疫耐受被打破。最近研究显示,tDCs作为一种免疫细胞用于自身免疫紊乱的治疗已取得成功,如自身免疫性脑脊髓炎、胶原或佐剂诱发的关节炎、Ⅰ型糖尿病等已有临床试验报道。我们参照国外有关文献,用不同的细胞因子体外诱导产生tDCs,用主动免疫法建立ITP动物模型,研究tDCs对ITP的防治作用,并探讨其可能机制。研究目的：1.探讨不同细胞因子在诱导培养小鼠骨髓耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells, tDCs)中的作用,观察不同因子组合培养条件下tDCs的形态学、细胞表型和功能变化,寻找培养细胞所需要的最佳细胞因子；2.建立免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia, ITP)小鼠模型,观察血小板数目、血小板平均体积等临床指标的变化；3.探讨TGF-β1和IL-10联合诱导的tDCs在ITP小鼠模型治疗中的作用及其机制。研究方法：1.tDCs的诱导培养：采用C57BL/6小鼠的骨髓细胞,分离单个核细胞。在含IL-4, TGF-β1、IL-10或TGF-β1和IL-10两种因子联合的RPMI1640培养基中诱导培养小鼠骨髓tDCs,按不同的组合分为五组进行体外诱导培养：imDC组(GM-CSF+IL-4)、mDC组(GM-CSF+IL-4+LPS),10-DCs组(GM-CSF+IL-4+ IL-10)、T-DCs组(GM-CSF+IL-4+TGF-β1),10T-DCs组(GM-CSF+IL-4+IL-10+TGF-β1)。并利用GFP慢病毒感染tDCs细胞。光镜及荧光显微镜下动态观察细胞形态,流式细胞术检测细胞CD80、CD86、I-A/I-E、CDllc、PD-L1、ILT3表达,WST法检测各组DC细胞刺激淋巴细胞增殖活性,qRT-PCR法检测IL-12和CCR7的mRNA表达水平,ELISA法检测细胞培养上清中IL-10和TGF-β的分泌水平和混合淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-10和TGF-β的分泌水平。2.ITP小鼠模型的建立：应用抗血小板自身抗体MWReg30抗体(模型组)或PBS(对照组)腹腔免疫BALB/c纯种小鼠,分别于免疫后的第1h,3h,24h,48h,72h,96h,120h取血检测血常规,监测血小板计数及平均血小板体积(MPV)水平的变化,并应用流式细胞术检测血小板相关抗体(PAIgG),应用ELISA法检测外周血中Thl相关细胞因子IFN-γ、IL-2和Th2型细胞因子IL-4、IL-10及TGF-β水平,同时观察骨髓细胞形态学,尤其是巨核细胞系的数量和发育情况。3.tDCs在ITP小鼠模型治疗中的作用及其机制研究：ITP小鼠体内输注GFP慢病毒转染后的用GM-CSF、IL-4、IL-10、TGF-β细胞因子体外联合培养诱导的小鼠tDCs。实验分两组：治疗组(输tDCs)和对照组(输PBS)。输注抗体1h后接受细胞或PBS治疗,免疫荧光进行细胞体内定位的研究；于免疫后的第1h,3h,24h,48h,72h,96h,120h取血监测血小板计数,应用ELISA检测外周血中Thl相关细胞因子IFN-γ、IL-2和Th2型细胞因子IL-4、IL-10及TGF-β水平；流式细胞术检测外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例。结果：1.小鼠骨髓来源的单个核细胞,体外经GM-CSF、IL-4、IL-10和／或TGFβ联合诱导培养可生成耐受性树突细胞(tDCs)。2.各组tDCs的特点：1)10-DCs,与mDCs相比,高表达DCs的特异性标记物CD11c,低表达I-A/I-E和共刺激分子CD80和CD86,高表达抑制性分子PD-L1和ILT3;刺激淋巴细胞增殖的能力降低；产生较低的IL-12和CCR7；分泌较高水平的IL-10和TGF β；与淋巴细胞共培养上清中,IFNγ的水平较低,IL-10的水平较高,但TGFβ的水平未有显著变化。2)T-DCs,与mDCs相比,高表达DCs的特异性标记物CD11c,低表达I-A/I-E和共刺激分子CD80,高表达抑制性分子PD-L1和ILT3；刺激淋巴细胞增殖的能力未显著降低；产生的IL-12和CCR7未有显著变化；分泌较高水平的TGFβ,IL-10的分泌量未有显著变化；与淋巴细胞共培养上清中,IFN α的水平较低,IL-10和TGF β的水平较高。3)10T-DCs,与mDCs相比,高表达DCs的特异性标记物CD11c,低表达I-A/I-E和共刺激分子CD80和CD86,高表达抑制性分子PD-L1和ILT3；刺激淋巴细胞增殖的能力降低；产生较低的IL-12,CCR7的表达无明显变化；分泌较高水平的IL-10和TGFβ；与淋巴细胞共培养上清中,IFN γ的水平较低,IL-10和TGFβ的水平较高。3. ITP小鼠模型的建立和相关检测：1)GFP慢病毒转染tDCs后,细胞成功呈现绿色荧光,且并未改变细胞的表型。2)BALB/c小鼠接受MWReg30抗体腹腔注射,与对照组相比,1h后血小板数出现明显下降(P<0.05),并在48h达到最低点,与对照组存在显著性差异(P<0.001)。并于120h回升至正常。3)造模时,随着血小板计数的下降,血小板平均体积相应的增大,至24h时己与对照组存在显著性差异(P<0.05),并于48h达到最大值并持续至120h(P<0.001),且血小板平均体积与血小板计数存在负相关关系。而骨髓巨核细胞形态和数量均无显著变化。4)造模组小鼠体内的PAIgG水平明显高于对照组,差异有统计学意义。5)造模组小鼠血清中IFN-γ和IL-4的水平均出现不同程度的升高。与小鼠未接受抗体注射(0 h)时的因子水平相比,IFN-γ在注射抗体3h后即出现统计学差异(P<0.05),至120h恢复正常；而IL-4则在注射抗体24h后出现升高,且差异有统计学意义(P<0.05),至96h恢复正常。而IL-2、IL-10及TGF-β因子水平均无明显变化。4.tDCs在ITP小鼠模型治疗中的作用及其机制1)lOT-DCs治疗组相比较PBS对照组明显增加了ITP小鼠的血小板数目。2)lOT-DCs治疗组小鼠外周血血清中的IFN-γ水平,相比较PBS对照组小鼠,在接受MWReg30抗体注射后3h、24h、48h、72h均有不同程度的下降,且差异有统计学意义(P<0.05),而工L-4、IL-2、IL-I0及TGF-β其他因子水平均无明显变化。3)在荧光显微镜下观察,10T-DCs治疗组小鼠的脾脏内可见呈绿色荧光细胞。4)10T-DCs治疗组小鼠外周血中Treg细胞的比例较PBS对照组小鼠明显升高,差异有统计学意义。结论：1.GM-CSF、IL-4、IL-10和TGFβ联合诱导培养的tDCs效果最佳。2.建立了理想并稳定的ITP小鼠模型,为ITP细胞治疗的后续研究提供了有力的保障。3.耐受性树突状细胞可以经尾静脉迁移至脾脏并发挥作用,明显升高ITP小鼠的血小板数目、降低体内IFN-γ的水平。4.耐受性树突状细胞缓解ITP小鼠症状的治疗机制可能是通过上调小鼠体内Treg细胞的比例来实现的。