目的：多发性硬化是一种常见的中枢神经系统自身免疫性疾病，全球有超过250万患者受累。多发性硬化作为一种慢性疾病，在缓解期需要长期应用药物控制病情。目前用于多发性硬化缓解期的药物有干扰素-β，醋酸格拉默（GA），米托蒽醌等，但是这些药物不能完全控制多发性硬化的病情，并且由于这些药物需要皮下或静脉注射，长期应用有诸多不便。所以方便，副作用少的口服治疗逐渐受到欢迎。包括芬戈莫多，特立氟胺在内的一些口服药物在治疗多发性硬化的临床研究方面取得了肯定的结果，但在用药安全性方面尚需进一步评估。阿托伐他汀作为临床常用的降血脂药物，其安全性已经得到肯定。而且他汀的非调脂作用越来越多的引起人们的关注，尤其是他汀在自身免疫病的治疗方面取得令人意想不到惊喜。雷帕霉素是一种口服免疫抑制剂，主要用于抑制器官移植后的免疫排斥反应。雷帕霉素的有效性及安全性已经被一个开放的临床实验所证实。在这个临床实验中，临床确诊的RRMS或继发进展性MS接受雷帕霉素治疗后均明显受益，主要表现为新发的核磁增强病灶和发作次数减少，并且其毒副作用在可接受范围内。雷帕霉素在大鼠或小鼠的EAE动物模型中同样发挥作用，可以有效的抑制EAE发病初期和高峰期的病情。TH17和Treg的平衡与自身免疫性疾病密切相关。TH17是一种新的CD4+T细胞亚型，主要分泌IL-17、TNF-а等炎性细胞因子。有人发现在多发性硬化患者的脑组织和外周血中IL-17均异常高表达。Treg是另一大类CD4+T细胞亚型，在控制自身免疫病的发生发展中起着主要作用。近年来，随着Treg细胞表面标志物FOXP3+的确定更是大大促进了对Treg细胞的研究。越来越多的证据倾向于Treg功能失活是多发性硬化发病的主要原因。阿托伐他汀可能通过调节TH17和Treg的平衡来控制自身免疫性疾病。有研究发现雷帕霉素并非抑制全部的T细胞亚型增殖，在体外可以选择性扩展nTreg细胞亚群，并且可以在诱发1型糖尿病的NOD小鼠身上建立长期的免疫耐受。在哺乳动物的细胞中，雷帕霉素可以细胞内的免疫球蛋白FK506免疫蛋白-12（FKBP-12）结合形成复合物。这种复合物可以阻断一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的激活，这一类激酶被称为哺乳动物的雷帕霉素作用靶（mTOR），其与细胞周期进程，蛋白合成以及抑制抗原诱导的T或B细胞增殖密切相关。雷帕霉素可以与细胞内的免疫球蛋白FK506免疫蛋白-12（FKBP-12）结合形成复合物，进而这种复合物可以阻断mTOR的激活。mTOR信号通路与MAPK信号通路密切相关，阻断mTOR信号通路，势必会影响MAPK信号通路，进而减弱雷帕霉素的免疫抑制效应。阿托伐他汀同样可以扩增Treg细胞亚群。阿托伐他汀的免疫抑制作用与MAPK信号通路密切相关。阿托伐他汀的中间产物通过翻译后蛋白质修饰可以调节MAPK信号通路Ras，Rac的活性。而有研究表明ras-erk通路和rho-p38通路可以调节Treg细胞亚群。阿托伐他汀通过调节ras/rho通路诱导Treg细胞亚群。由此我们推论阿托伐他汀可以抑制雷帕霉素反馈性上调erk表达，增强雷帕霉素的免疫抑制效应。为阿托伐他汀联合雷帕霉素进一步临床应用治疗多发性硬化提供相关实验支持。方法：1.EAE模型建立将抗原MOG35-55用生理盐水稀释成5mg/ml，并按1∶1等体积加入CFA，加入结核杆菌H37Ra使其终浓度为4mg/ml，充分混合乳化。乳化后按每只0.1ml于C57BL/6小鼠脊柱两侧分四点皮下注射,第0h及第48h腹腔注射0.5ml PTX（500ng/只）。2.神经功能评分建立EAE模型后，分别用阿托伐他汀和雷帕霉素干预EAE小鼠。采用Knoz评分法每天给小鼠评分，连续观察30天，具体评分标准如下：0分无症状；1分尾部失去张力；2分后肢力弱；3分后肢瘫痪；4分后肢及前肢瘫痪；5分濒临死亡或死亡。筛选出阿托伐他汀和雷帕霉素的最佳临床剂量及亚临床剂量。之后将亚临床剂量的阿托伐他汀和雷帕霉素联合应用干预EAE小鼠并观察神经功能评分。3.免疫组化法检测IL-17的表达免疫后第17-21天，每组各取5只小鼠，经水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛灌流，取脊髓颈、胸、腰骶段石蜡包埋,5μm连续切片，进行IL-17免疫组化染色。日本OLYMPUS公司的光学显微镜观察切片，应用imagepro分析切片并计数。每只小鼠取8个不同的脊髓层面的切片，每张切片连续读取10个视野，取其平均值，进行统计学分析。4.流式细胞仪检测Treg细胞在每个流式上样管中加入100μl准备好的细胞悬液，细胞数约为1x106个。细胞表面染色，荧光单克隆抗体FITC-CD40.125μg/test（0.25μl）和APC-CD250.06μg/tes（t0.3μl）标记细胞表面CD4/CD25，4℃避光孵育30min；破膜，PBS洗1次，4℃,1000r/min,离心5min；弃上清后1ml固定破膜剂重悬细胞，4℃避光孵育2h（固定破膜剂将浓缩液和稀释液按1:3混合使用）；PBS洗1次；破膜剂缓冲液洗2次（缓冲液稀释10倍）；0.5μg/test（2.5μl）荧光单克隆抗体PE-Foxp3标记胞内Foxp3，4℃避光孵育30min，同时用PE Rat IgG2a同型抗体作为对照，4℃避光孵育30min；破膜剂洗2次，400μl冷FlowCytometry Staining Buffer重悬细胞，上流式细胞仪检测。5.ELISA的方法检测各组脾细胞上清中的细胞因子。确定所需的微孔条的数量。用缓冲液洗涤微孔条两次。微孔板的标准稀释：在所有标准孔中加入100μl样品稀释液，一式两份。在第一个孔中加入100μl标准液，将此100μl标准液从一个孔移到另一个孔从而制备成标准稀释液。从最后一个孔中减去100μl。选择管中的外部标准稀释液：向微孔条中加入100μl此种标准液。向空白孔中加入100μl样品稀释液，一式两份。向样品孔中加入50μl样品稀释液。向样品孔中加入50μl样品，一式两份。盖好微孔条并在室温下孵育2h。（18-25摄氏度）准备生物素结合物工作液。倒掉液体并用洗涤缓冲液洗涤微孔条4次。向所有孔中加入100μl生物素结合物工作液。盖好微孔条并在室温下孵育1h。（18-25摄氏度）。准备抗生物素蛋白链菌素。倒掉液体并用洗涤缓冲液洗涤微孔条4次。向所有孔中加入100μl稀释的生物素蛋白链菌素。盖好微孔条并在室温下孵育1h。（18-25摄氏度）。倒掉液体并用洗涤缓冲液洗涤微孔条4次。向所有孔中加入100μl TMB底物溶液。室温下孵育约10min。（18-25摄氏度）。向所有孔中加入100μl终止液。清空微孔读数并在450nm下测量色密度。我们收集脾胞上清用于检测Th1细胞因子IL-12,IFN-γ),Th17细胞因子(IL-17,IL-23), Th2细胞因子(IL-4, IL-10) andTreg细胞因子(TGF-β)。6.qRT-PCR检测erk，s6k，foxp3及rorc的表达情况首先从脾细胞中提取总RNA，之后鉴定RNA纯度和浓度。应用Oligo（dT）18逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。之后采用sybgreen法检测扩增变化。采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。计算方法是：目的基因相对表达倍数=2－△△C(t)，c(t)值是热循环仪中荧光达到荧光阈值的循环数，根据△c(t)实验组=c(t)目的基因-c(t)ACTIN，△c(t)对照组=c(t)目的基因-c(t)ACTIN，△△c(t)=△c(t)实验组-△c(t)对照组，对每一标本计算目的基因相对于对照组基因的相对定量结果。即其他各个样品相对于对照样品，目的基因mRNA转录水平的差异。7.western blot法检测erk及p-erk的表达从脾细胞中提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。根据蛋白浓度上样，之后电泳，浓缩胶:80V;分离胶:100V,直到所需marker条带跑完后停止电泳。电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，100V恒压条件下电转120min，将蛋白转移到PVDF膜上。用封闭液（含5%脱脂牛奶的TBST溶液）室温封闭PVDF膜1h。一抗孵育：封闭液稀释erk，p-erk及actin抗体，然后与封闭好的PVDF膜4℃过夜。二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜2h。加ECL、曝光、显影、定影。8.统计方法采用SPSS13.0软件进行统计分析，各项指标以均数±标准差表示(x±s)；临床神经功能评分资料应用Mann-Whitney U检验；其余计量资料均数的两组间比较应用ANOVA方差分析。P<0.05具有统计学意义。结果：1.大剂量阿托伐他汀（10mg/kg）可以改善EAE小鼠病情，而小剂量阿托伐他汀（1mg/kg）对EAE小鼠病情无明显影响。大剂量雷帕霉素（1mg/kg）可以改善EAE小鼠病情，而小剂量雷帕霉素（0.3mg/kg）对EAE小鼠病情无明显影响。而小剂量阿托伐他汀（1mg/kg）和小剂量雷帕霉素（0.3mg/kg）联合应用后同样可以改善EAE小鼠病情。2.大剂量阿托伐他汀（10mg/kg）和大剂量雷帕霉素（1mg/kg）都可以抑制炎性细胞因子IL-17浸润EAE小鼠的中枢神经系统。小剂量阿托伐他汀（1mg/kg）和小剂量雷帕霉素（0.3mg/kg）联合应用后同样抑制炎性细胞因子IL-17浸润EAE小鼠的中枢神经系统。3.大剂量阿托伐他汀（10mg/kg）和大剂量雷帕霉素（1mg/kg）都可以促进EAE小鼠的Treg细胞分化。小剂量阿托伐他汀（1mg/kg）和小剂量雷帕霉素（0.3mg/kg）联合应用后也可以促进EAE小鼠的Treg细胞分化。4.我们收集脾胞上清用于检测Th1细胞因子IL-12, IFN-γ),Th17细胞因子(IL-17,IL-23), Th2细胞因子(IL-4, IL-10) and Treg细胞因子(TGF-β)。联合治疗组与实验对照组相比可以抑制IL-12, IFN-γ,IL-17和IL-23炎性细胞因子同时诱导IL-4, IL-10和TGF-β抗炎性细胞因子。5.雷帕霉素可以上调erk表达，阿托伐他汀可以下调erk表达。联合应用后阿托伐他汀可以抑制雷帕霉素反馈性上调erk表达。阿托伐他汀对雷帕霉素的下游通路s6k无明显影响。阿托伐他汀和雷帕霉素联合应用可以上调foxp3表达同时下调rorc的表达。6.我们应用western blot的方法进一步从蛋白水平证实阿托伐他汀和雷帕霉素对ERK表达的影响。阿托伐他汀大剂量组和小剂量组均对ERK表达有抑制作用，而雷帕霉素（1mg/kg/d和0.3mg/kg/d）则可以上调ERK的表达。小剂量雷帕霉素（0.3mg/kg/d）和小剂量阿托伐他汀联合应用后ERK的表达水平明显较雷帕霉素单独应用时降低。结论：MOG35-55诱导的EAE模型可以用于检验可能对治疗多发性硬化有作用的药物联合。亚临床剂量的雷帕霉素和阿托伐他汀联合应用可以改善EAE的病情，而同样剂量单药则对EAE的病情无明显改善。联合治疗减少中枢神经系统内炎性细胞因子IL-17的浸润并且增加外周Treg细胞的比例。联合治疗促进保护性Th2和Treg的细胞因子分泌，抑制炎性Th1和Th17的细胞因子产生。阿托伐他汀可以抑制雷帕霉素反馈性上调ERK的表达，且阿托伐他汀对雷帕霉素作用的PI3K/AKT/mTOR通路无明显影响。阿托伐他汀和雷帕霉素通过不同的信号通路调节免疫反应且可以互补缺点。阿托伐他汀和雷帕霉素是治疗自身免疫性疾病的一对优秀组合。