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谢瓦氏曲霉间型变种俗称“金花菌”,是茯砖茶发花过程中的优势菌种,决定着茯砖茶的品质,并且与茯砖茶的保健和安全机制相关。早期的研究发现,谢瓦氏曲霉间型变种的有性和无性繁殖受渗透压的调控,可以作为研究丝状真菌有性和无性发生机制的模式菌种。因此,谢瓦氏曲霉间型变种展开分子生物学研究工作既具有现实意义又具有理论价值。我们实验室率先展开了谢瓦氏曲霉间型变种基因水平的研究工作,目前已构建根癌农杆菌介导的遗传转化体系以及克隆并敲除产孢相关基因。然而较低基因敲除效率和单一的选择标记阻碍了研究工作开展。因此,有必要引入新的选择标记并在此基础上构建易于获得基因敲除菌株的基因工程菌株。本研究首先以质粒pUR5750为模板,克隆了启动子PgpdA、G418抗性基因nptⅡ和终止子TtrpC;然后以质粒pcDNA3.1 (+)为中间载体,构建了适用于丝状真菌G418抗性的nptⅡ基因表达盒PgpdA-nptⅡ-TtrpC,并置换双元载体pDHt/sk-bar的bar基因表达盒,构建了G418抗性的双元载体pDHt/sknt;最后以nptⅡ基因为选择标记,采用根癌农杆菌介导的转化方法实现了谢瓦氏曲霉间型变种的遗传转化。PCR和southern blot分析证实,nptⅡ基因成功整合到谢瓦氏曲霉间型变种菌株基因组中,并且所分析的转化子均是以单拷贝的形式整合到基因组中的。遗传稳定性的实验结果表明,nptⅡ转化子遗传稳定性好。这表明双元载体pDHt/sknt可以用于根癌农杆菌介导的遗传转化,nptⅡ基因可以作为选择标记应用于谢瓦氏曲霉间型变种的基因研究中。在上述实验基础上,本研究构建了ku70基因敲除菌株。首先,通过序列比对分析,找出Ku70蛋白保守区域并设计简并引物,克隆了ku70基因cDNA片段,利用RACE和染色体步移技术获得了ku70基因序列及侧翼序列。然后,在双元载体pDHt/sknt上构建ku70基因敲除载体pDHt/sknt-D-U,通过根癌农杆菌介导的方法,转化谢瓦氏曲霉间型变种,得到ku70基因敲除菌株Δku70。最后,本研究比较了△ku70与野生型菌株的表型,并构建了veA基因敲除载体,分别在Δku70和野生型菌株敲除veA和flbA基因,比较了基因敲除的效率。实验结果表明：与野生型菌株相比,△ku70菌株生长速率略慢,对温度和渗透压的响应与野生型一致,对EMS和H202不敏感,其他菌落形态和显微结构特征没有明显变化,然而△ku7O菌株中基因敲除的效率高达80%以上。本研究初步表明,Δku70菌株可以用来快速筛选谢瓦氏曲霉间型变种的功能基因。