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由于巨型艾美耳球虫(Eimeria.maxim)具有免疫原性最强、可产生母源免疫以及对其它虫种具有交叉保护力等特点,因而针对E.maxima抗原的研究具有很大意义。受传播阻断免疫研究的启发,针对E.maxima配子体抗原的研究已取得了极大进展。本文以E.maxima配子体GAM56抗原为研究对象,进行如下研究:
分析已发表GAM56基因的抗原表位,选取含有绝大部分抗原表位的一段基因设计引物。收集配子体,提取RNA,通过RT-PCR法得到GAM56基因片段。将其与pGEM-TEasy载体连接后转化进JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选、双酶切鉴定后,阳性质粒进行测序。结果表明,扩增产物大小为912bp(含酶切位点),可编码218个氨基酸,与已发表序列的同源性达到99.9%。将测序正确的GAM56片段切胶回收,和pGEx-6p-1表达载体连接,转化入BL21感受态细胞中。经双酶切和PCR鉴定为阳性的菌株,用1.0mMIPTG诱导4~6h,表达分子量为60.9KDa的GST-GAM56融合蛋白。融合蛋白主要以包涵体的形式表达,通过处理包涵体和Sepharose4B柱亲和纯化作用得到大量纯化的GST-GAM56蛋白。使用GST-3C蛋白酶切除融合蛋白的GST标签,通过SDS-PAGE凝胶电转移回收得到GAM56蛋白。使用Westernblot方法检测融合蛋白的抗原性。
将GST-GAM56蛋白和GAM56蛋白分别设高(120ug)、中(80ug)、低(40ug)三个免疫剂量组加佐剂免疫,另设GST-GAM56蛋白不加佐剂免疫组和空白对照组、不免疫攻虫组、卵囊免疫组,在鸡7日龄和17日龄时分别进行免疫,27日龄时每组分10万剂量和1000剂量攻虫,看两种蛋白的抗球虫综合指数、体液免疫水平和细胞免疫水平。结果表明,使用GAM56蛋白加佐剂免疫,可使卵囊减少率达到70%,抗球虫综合指数较高,可刺激机体产生较高的体液免疫水平。GST-GAM56蛋白的免疫保护力明显低于GAM56蛋白。两种蛋白的细胞免疫水平均较低,主要产生以体液为主的免疫。