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小反刍兽疫(Peste des petits ruminants)和蓝舌病(Bluetongue)是严重危害山羊、绵羊等家养及野生反刍动物的烈性传染性疾病；分别由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)和蓝舌病病毒(B1uetongue virus,BTV)引起的病毒病。迄今为止,PPR和BT无特效药,只能通过疫苗接种进行防治。反向遗传操作作为病毒学技术,可利用该技术开展RNA病毒各方面的研究,特别是将RNA病毒开发成病毒载体用于研发新型疫苗。曾有PPRV迷你基因组建立的报道,证明了PPRV反向遗传操作系统建立的可行性,但此后一直未见PPRV成功救获的报道,这严重阻碍了PPRV毒力机制、重组载体疫苗开发等方面的研究进展。为了能够区分PPR自然感染和免疫感染并有效的对PPR进行防控,本研究采用反向遗传操作技术,构建了表达两种不同形式的GFP标记疫苗,并以此为基础优化病毒中和试验；同时构建了表达我国12型蓝舌病病毒结构蛋白的PPRV全长cDNA并进行体外拯救,对获救的重组病毒生物学特性进行分析而开展了系列研究：试验Ⅰ.表达GFP的小反刍兽疫Nigeria75/1疫苗株的构建及生物学特性研究本研究根据PPRV Nigeria75/1疫苗株构建了的感染性全长cDNA,以此为基础,构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的全长cDNA克隆。将插有GFP基因的全长cDNA(4μg/)克隆及三个辅助质粒pCA-N(2μg/孔).pCA-P(1μg/)和pCA-L(1μg孔)采用脂质体转染法转入Vero细胞内,救获病毒命名为rPPRV/GFP,首次拯救出了表达外源基因的PPRV重组病毒。该重组病毒在Vero细胞上的多步动力学生长曲线与亲本毒株相似,其最高生长滴度可达107.4TCID50/mL:经间接免疫荧光(IFA)及蛋白免疫印迹(Western-blot)分析得知,重组病毒在Vero细胞上不仅能够表达病毒自身抗原,也能够表达GFP抗原；同时,将重组病毒在Vero细胞上多次传代,通过对传代病毒的毒价滴定及GFP荧光强度的定量分析可知,重组病毒在传代过程中依然能够稳定复制增殖并稳定表达外源蛋白.rPPRV/GFP和wtPPRV/N75/1按103 TCID50的剂量各免疫山羊(0.5～1.5岁)4只,同时设置PBS注射的对照组(4只),于免疫前及免疫后第2、4、6周采血进行PPRV中和抗体检测,两个毒株免疫的所有羊的PPRV中和抗体效价在免疫2周后全部转阳性(>10),在6周内,两者抗体水平都基本维持不变。与wtPPRV/N75/1的效价比较,用GraphPad Prism软件进行2way ANOVA分析,二者差异不显著(P>0.05)。结果表明重组毒株保持了亲本毒株的免疫原性,在P和M基因之间插入外源基因并未影响到亲本毒株的免疫原性。试验Ⅱ.表达锚定型GFP的小反刍兽疫Nigeria75/1疫苗株的构建及生物学特性研究传统的弱毒疫苗株免疫后,不能通过血清学方法区分PPR自然感染和免疫感染。本研究在选用GFP作为标记蛋白的基础上对其进行修饰,使其N端具有组织纤维蛋白溶酶抗原(tPA)的信号肽(sIG),c端具有H3N2型流感病毒HA蛋白跨膜锚定序列(ANC),之后构建出一株表达该锚定型GFP基因的小反刍兽疫病毒的全长cDNA克隆,该克隆连同三个辅助质粒一起经脂质体转染法转进Vero细胞内,获得重组病毒并命名为rPPRV/GFP-SA。该重组病毒保持了亲本毒株的生长学特性,在Vero细胞上的多步动力学生长曲线与亲本毒株相似,第5 d病毒滴‘度可达峰值108,34 TCID50/mL；经间接免疫荧光(IFA)及蛋白免疫印迹(Western-blot)分析可知,重组病毒在Vero细胞上不仅能够表达自身病毒抗原,也能够表达修饰后的GFP抗原。通过激光共聚焦观测,修饰后的GFP成功的锚定在Vero细胞膜上,细胞内残留极少；而相应的未修饰的GFP则积聚在细胞质和细胞核内,未能锚定在细胞膜上。rPPRV/GFP和 rPPRV/GFP-SA按105 TCID50的剂量免疫2组(每组5只)0.5～1.5岁绵羊,间隔3周,相同剂量加强免疫1次,并于免疫前、一免3周及二免2周采血进行抗体分析。两组羊在两个时间点所测PPRV抗体,用GraphPad Prism软件进行2way ANOVA分析,二者差异不显著(P>0.005)。但是rPPRV/GFP-SA免疫的羊的PPRV抗体水平与GFP抗体水平一定程度上呈正相关关系,其PPRV抗体效价高,对应的血清中就能检测到GFP抗体,可能是因为颈部皮下免疫过程中存在扎穿皮肤的情况而导致免疫失败,待重新进行动物试验验证。而rPPRV/GFP几乎不能诱导GFP抗体的产生,仅有1472一免后产生了GFP抗体但很快下降。试验Ⅲ.表达12型BTV结构蛋白的小反刍兽疫Nigeria75/1疫苗株的构建及生物学特性研究蓝舌病病毒的VP2蛋白是诱导BTV保护性中和抗体的主要免疫原,VP5蛋白虽然不然诱导病毒产生中和抗体,但是可以协助VP2蛋白产生更高水平的中和抗体；VP3、VP7蛋白构成病毒内衣壳,VP7蛋白可以诱导机体产生保护性的反应；同时,VP2、VP5和VP7蛋白上有CTL表位。本研究成功构建了分别表达我国12型蓝舌病病毒分离株的VP2、VP3、VP5和VP7基因的全长cDNA克隆,将4个全长cDNA分别与三个辅助质粒按照4：2：1：1的比例混合后,采用脂质体转染方法将混合物转入Vero细胞内,体外成功拯救出重组病毒rPPRV/BTV12-VP5和rPPRV/BTV12-VP7。两个重组病毒能够稳定的复制增殖,在Vero细胞上的生长动力学曲线与亲本毒株相似；同时,经间接免疫荧光(IFA)及免疫印迹(Western-blot)分析,获救病毒在Vero内可以表达出VP5和VP7蛋白。rPPRV/BTV12-VP5和rPPRV/N75/1按107 TCID50的剂量各免疫5只山羊(0.5～1.5岁),同时设置PBS注射的对照组(5只),3周后相同剂量加强免疫1次,于免疫前、一免3周和二免2周后采血进行中和抗体分析,所有羊在一免3周全部转阳(≥82.5),二免2周抗体上升(≥325.5),结果表明重组病毒和亲本毒株一样可以诱导动物机体产生高水平的PPRV保护性中和抗体,用GraphPad Prism软件进行2way ANOVA分析,二者差异不显著(P>0.05),但是在山羊体内诱导产生的VP5抗体水平不高。研究结果表明,rPPRV/BTV12-VP5保持Nigeria75/1弱毒疫苗株生物学特性、免疫学特性,可以有效的表达VP5蛋白但是却不能有效的诱导动物机体产生针对VP5蛋白的抗体,这可能和VP5蛋白自身免疫原性有关。由于时间关系,表达VP7蛋白的重组病毒未能进行动物试验,同时构建的表达VP2和VP3基因的PPRV全长cDNA可能因为插入外源基因太长或其他原因至今尚未拯救出重组病毒。但是重组病毒rPPRV/BTV12-VP5和rPPRV/BTV12-VP7的成功拯救,为将来研发安全有效的蓝舌病及小反刍兽疫重组二联活疫苗奠定了基础。试验Ⅳ.表达GFP的重组小反刍兽疫病毒在病毒中和试验中的应用有效的诊断方法是PPR防控及疫苗效率检测的重要措施之一,病毒中和试验(VNT)作为黄金标准被OIE推荐,该方法灵敏、特异、结果可靠,但缺点是太耗时,而且CPE结果的观察需要有经验人士进行观察,特别是在低浓度稀释血清时,我们无法区分是血清内的可能存在的有毒物质导致还是病毒引起的细胞死亡。本研究在传统的VNT的基础上,用rPPRV/GFP替代wtPPRV/N75/1,首先选择1份PPRV抗体阳性血清进行分析,采用rPPRV/GFP作为检测抗原的VNT,其结果通过观察感染的Vero细胞发出的荧光即可,取代了观察CPE,有效避免了在观测结果时的观察者主观性的影响,同时确定了优化后的VNT结果统计的最佳时间为笫6 d。随后随机挑选出rCPV-PPRVH免疫的山羊、绵羊血清各10份,以及vtPPRV/N75/1免疫的山羊血清10份,采用两种VNT方法检测这30份血清的PPRV抗体,二种检测方法所获得抗体效价经T-test分析后,P>0.05,差异不显著,结果表明rPPRV/GFP作为检测抗原可以替代wtPPRV/N75/1用于VNT中。改进后的VNT不仅容易观察判定结果,更重要的是大大缩短了判定结果的时间,为今后PPR的防控提供了可靠的方法。