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目的通过研究Trib3基因敲除的雄性大鼠及分析该基因在不同时期野生型大鼠睾丸内的表达情况,探究该基因在生殖过程中所发挥的作用。方法(1)Trib3基因在野生型大鼠精子生成过程中的表达研究:从2至65日龄雄性野生型Wistar大鼠中选取21个时间点三只窝别不同的大鼠,提取睾丸组织后用Real-time q PCR检测各时间点Trib3基因m RNA的转录水平;Western blot检测各时间点TRIB3蛋白的表达水平;免疫组织化学方法观察TRIB3蛋白表达定位情况。(2)Trib3基因敲除对雄性大鼠生殖功能影响的研究:取成年雄性纯合型(-/-)、杂合型(+/-)、野生型(+/+)Wistar大鼠;分别与野生雌鼠交配,分析受孕率、胎鼠数及自然生产数,HE染色观察后代18日龄三种基因型大鼠睾丸组织差异;提取成年大鼠睾丸组织,RT-PCR产物测序检查证实纯合型和杂合型突变;提取睾丸组织总蛋白,Western blot检测基因敲除后TRIB3蛋白的表达情况;HE染色和免疫组织化学染色对比三种基因型成年大鼠睾丸组织形态结构及TRIB3蛋白的表达定位;Real-time q PCR观察Trib3基因和各标记基因转录水平的表达,推测精子发生情况;提取附睾精子计算机辅助分析活力指标及浓度。结果(1)2至65日龄野生型大鼠睾丸组织中Trib3基因m RNA均见表达,2-12日龄较高,4日龄达高峰;14-16日龄与2-12日龄间差异无显著性(P>0.05);20-35日龄与14-16日龄比较,Trib3 m RNA的表达量显著降低(P<0.05);40-65日龄与20-35日龄比较,Trib3 m RNA的表达量显著升高(P<0.05)。2至65日龄TRIB3蛋白均见表达,2-12日龄TRIB3呈现较高表达;14-16日龄与2-12日龄比较,TRIB3表达量显著降低(P<0.05);20-35日龄与14-16日龄间TRIB3表达量差异无显著性(P>0.05);40-65日龄与20-35日龄比较,TRIB3的表达量显著升高(P<0.05)。免疫组织化学染色可见5日龄的睾丸组织精原干细胞胞质部分及部分睾丸间质呈现阳性结果,12日龄、18日龄、29日龄及40日龄中睾丸间质的结缔组织纤维部分呈阳性结果。(2)与野生型碱基序列比对,纯合型和杂合型Trib3基因exon3缺失;各基因型大鼠TRIB3蛋白表达均呈阳性;交配实验中各组胚胎数及自然生产数差异均有统计学意义(P<0.05),后代18日龄三种基因型大鼠睾丸组织结构均完整,未见明显差异;成年大鼠睾丸组织形态对比,各基因型之间未见明显差异,TRIB3蛋白表达各组均于睾丸间质部分呈现阳性;标记基因CDH1、SYCP3、TP2的m RNA表达量在三种基因型大鼠中无明显差异(P均>0.05),纯合型Trib3 m RNA未检测到表达,杂合型较野生型Trib3 m RNA表达量降低;纯合型、杂合型大鼠精子浓度显著低于野生型(P<0.05),各组精子活力指标无显著差异(P均>0.05)。结论(1)该基因可能参与大鼠精原干细胞的增殖过程。(2)敲除Trib3基因后,大鼠能够产生精子和交配出后代,基因敲除鼠与野生雌鼠交配出的后代与野生型后代大鼠相比睾丸结构未见明显异常。(3)敲除Trib3基因会导致大鼠精子数下降,不影响精子活力指标,该基因可能是参与精子生成的关键基因之一。(4)Trib3基因可能在睾丸间质中发挥作用。