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酰基转移酶在细胞的生命活动中扮演着重要的角色。首先,它能够调控细胞能量的贮存、传递和释放;其次,它能够调控磷脂的结构从而维持细胞膜和细胞器的结构与功能的完整性;再次,它的底物还可以作为第二信使,调控细胞的生理功能,并参与各种疾病的病理过程。其中,单酰基甘油单酯转移酶-2(Monoacyglycerol Acyltransferases-2,MGAT2)和二酰基甘油二酯转移酶-1(Diacylglycerol Acyltransferases-1,DGAT1)是调控甘油三脂(Triacylglycerols,TAG)合成的关键酶;心磷脂酰基转移酶-1(Lysocardiolipin Acyltransferase-1,ALCAT1)和溶血酰磷脂酰基转移酶-1(Lysophosphatidylglycerol Acyltransferase-1,LPGAT1)是调控磷脂代谢和线粒体功能的关键酶。目前,MGAT2和DGAT1的相互作用位点以及这种相互作用在催化甘油三酯(Triacylglycerols,TAG)合成过程中的作用与机制,ALCAT1和LPGAT1表达变化对线粒体的形态与功能的影响以及其对氧化应激引起线粒体损伤的调控作用,MGAT2/DGAT1与LPGAT1/ALCAT1在病毒复制中的作用,还有待进一步的深入研究。本文分别通过过表达和下调的方式,研究MGAT2/DGAT1、LPGAT1/ALCAT1这两组酶在TAG合成、线粒体损伤和病毒复制中的作用和机制。研究取得以下结果。1.MGAT2和DGAT1是TAG在小肠合成中的关键酶,为了研究这两者的相互作用及对TAG合成的影响,将这两个酶在细胞中过表达。Tris-甘氨酸-PAGE电泳显示,MGAT2自身能够形成二聚体和四聚体,也可以与DGAT1形成特异性的二聚体,但并不与DGAT2形成二聚体。通过构建片段序列删除的MGAT2和DGAT2质粒,并进行分析表明,MGAT2的信号肽序列虽然与二聚体的形成无关,但是对酶的活性至关重要,而DGAT1序列中的第35~80个氨基酸是形成自聚体并且与MGAT2形成相互作用的位点。异源性的MGAT2与DGAT1复合酶二聚体有助于加速和促进细胞内TAG的合成。2.构建了能够稳定表达LPGAT1、ALCAT1的H9C2细胞系。首先在线粒体形态上,激光共聚焦实验显示LPGAT1能够显著降低由ALCAT1过表达所引起的线粒体点状断裂,使其向棍棒状与点状的混合态转变。在H2O2刺激的氧化应激条件下,LPGAT1能够缓解ALCAT1上调所引起的H2O2泄露、mtDNA丢失、细胞内脂质过氧化、以及细胞内氧化应激基因的升高。线粒体呼吸功能检测结果显示,LPGAT1单独高表达组的线粒体的耗氧率最高,LPGAT1可以缓解由ALCAT1单独高表达引起的线粒体呼吸功能障碍,LPGAT1同时也可以缓解由ALCAT1引起的自噬小体的增加。上述结果说明,在氧化应激条件下,LPGAT1和ALCAT1可以通过相互间的作用进而调控细胞线粒体的结构与功能,进而影响细胞的能量代谢与生长活性。3.在传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)感染的PK-15细胞,油红O染色显示细胞内中性脂肪酸含量随着病毒感染剂量的增加而增加。ELISA试剂盒检测进一步证实细胞中增加的中性脂肪酸主要是DAG而非TAG。qPCR检测显示TGEV感染后MGAT2,DGAT1,ATGL的表达量增高,通过siRNA分别下调细胞中的DAG合成酶和分解酶,发现DAG的含量变化与病毒的复制量和病毒的滴度成正相关,但对病毒的吸附和进入无显著相关性。Western blotting显示TGEV感染后可以通过调节DAG的量进而激活PKC信号通路。此外,TGEV感染会引起线粒体形态学上的损伤。但是ALCAT1和LPGAT1的表达量在感染后并没有明显变化,因此ALCAT1和LPGAT1并没有参与TGEV诱导的线粒体损伤过程。本研究阐明了MGAT2能够通过与DGAT1形成多聚体的形式促进TAG的合成;在LPGAT1与ALCAT1共同存在的情况下,LPGAT1可以在一定程度上缓解在氧化应激条件下ALCAT1上调所引起的线粒体损伤;TGEV感染PK-15细胞后,细胞内的MGAT2、DGAT2、ATGL表达量升高,从而使第二信使DAG含量的增加,激活PKC信号通路,继而影响病毒的复制,但TGEV感染并不引起ALCAT1和LPGAT1的表达量的变化。研究结果揭示了酰基转移酶MGAT2/DGAT1与LPGAT1/ALCAT1在脂肪合成、线粒体损伤和病毒复制中的作用及机制,为进一步探索脂代谢关键酶在细胞生理代谢和病毒复制中的作用奠定基础。