蛋白质是生命活动的载体和功能执行者,研究其结构与功能的关系对揭示生命奥秘十分重要,也是发展蛋白质工程和新型药物设计所必需的基础。液体核磁共振波谱技术可以在溶液状态下测定蛋白质分子结构,并给出丰富的运动信息。我们利用液体核磁共振波谱技术对流感病毒融合肽及其两个功能明确的突变体进行了结构研究；解析了三个芋螺毒素和一个蝎毒素的溶液结构,从分子水平上阐述了它们的生物活性与空间结构之间的关系。研究内容分两部分：一.流感病毒融合肽及其两个突变体结构研究流感病毒严重威胁人类健康,流感病毒感染人体的关键步骤是病毒膜与细胞膜融合,从而使病毒进入人体。融合过程中融合蛋白——血凝素起关键作用,为逃避免疫系统监视,血凝素不断突变,但是其HA2结构域N端的一段疏水序列高度保守,在融合过程中起重要作用,被称为融合肽。2001年Tamm小组解析了来自血凝素H3亚型20个氨基酸的流感病毒融合肽(H3-HAfp20)结构,呈倒“V”状结构。2010年Bax小组解析了来自血凝素H1亚型23个氨基酸的流感病毒融合肽(H1-HAfp23)结构,发现含有C-端保守的Trp21-Tyr32-Gly23序列后,融合肽形成由两段α-螺旋连接而成的发夹状螺旋结构。血凝素H1-和H3-亚型的融合肽序列有2个氨基酸的差别,其中12位氨基酸的Gly或Asn突变在所有16个亚型中都非常保守。该残基位于结构的转角位置,决定了螺旋结构的走向。为研究流感病毒第12位氨基酸对结构的影响及结构与功能关系,我们用大肠杆菌系统表达并纯化了血凝素H3亚型23个氨基酸的流感病毒融合肽(H3-HAfp23),采用异核谱解析结构,发现H3-HAfp23呈发夹状螺旋结构,与H1-HAfp23相比第二个螺旋整体下移,使12位和16位氨基酸之间的距离变大以便容纳Asn较大的侧链。通过序列比对及结构分析我们认为血凝素16个亚型的23个氨基酸的融合肽在DPC胶束中都应是保守的发夹状螺旋结构。为了进一步研究流感病毒融合肽结构与功能的关系,我们选择了H3-HAfp23的突变体G1S和G1V,其中G1S只能融合外层膜,内层膜仍保持独立结构,G1V则完全没有融合功能。G1S与H3-HAfp23结构类似,但两个螺旋间的氢键减少,N端和C端的相互作用变弱,只有Ser1的CO与Trp21的吲哚环NH形成氢键。G1V的结构与H3-HAfp23完全不同,两个螺旋间没有相互作用,N端和C端距离很远,是部分张开的发夹结构。结构数据表明随着融合功能的减弱直至丧失,融合肽发夹结构的夹角逐步被打开,显示了闭合型发夹结构对流感病毒融合功能的重要性。这是由于在酸性溶液中发夹结构N端NH3+所带的正电荷可以被C端残基中和,这种N端与C端的电荷-偶极相互作用对融合肽插膜过程很重要,这也被Mn2+滴定实验所证实。二.三个芋螺毒素和一个蝎毒素的结构解析生物毒素大多数是活性多肽,作用于细胞膜上的受体与通道,研究毒素多肽的结构与功能有助于了解离子通道调节的分子机制,也是药物设计的重要基础。我们与其他单位合作研究了三个芋螺毒素和一个蝎毒素的液体核磁结构。其中芋螺毒素均具有镇痛活性,除4/7型α-芋螺毒素Eb1.6外,T1和L11都是全新的毒素结构,由于作用靶点的研究还在进行之中,对结构和功能的阐述还有待深入。蝎毒肽BmP05特异性作用于SK通道,将其突变成BmP05-T后发现可以同时作用于Kv1.3通道和SK通道,丙氨酸扫描实验显示BmP05-T很可能以β-折叠识别Kvl.3通道和SK通道。我们发现BmP05-T的溶液结构与野生型的三级结构基本一致,但是突变的氨基酸改变了酸性氨基酸在结构表面的分布,支持了合作方提出的酸性氨基酸残基的分布决定了蝎毒肽和钾离子通道相互作用表面的理论假设。BmP05-T的结构显示以β-折叠识别SK通道,为BmP05-T与SK通道相互作用的新机制研究奠定了结构基础。