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蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7, Sucrose Phosphorylase, SPase)是催化蔗糖磷酸解反应生成a-D-葡萄糖1-磷酸(αG1P)和D-果糖及其可逆反应的特异性酶,主要存在于乳酸菌和双歧杆菌中。基于SPase的催化特性,其主要应用于低聚糖的合成、含醇羟基、羧基及酚羟基化合物的修饰和改造以及不稳定化合物衍生物的催化合成,因而在食品和化妆品行业中具有广泛的应用前景。由于野生型菌株中存在复杂的代谢调控机制,SPase蛋白在这些菌中的含量并不高。因此通过基因工程手段构建重组菌株,高效表达蔗糖磷酸化酶对实现SPase的工业化生产十分必要。本研究成功克隆了来自实验室保存的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) SPase基因spase,完成了该基因在大肠杆菌中的重组表达,并对SPase蛋白的重组表达进行了初步优化,对纯化后酶的酶学性质进行了鉴定和分析。首先,我们以NCBI数据库中双歧杆菌SPase基因为模板设计引物,克隆得到B. longum ZJ0521 SPase编码基因spase。生物信息学分析表明：该基因全长为1521 bp, GC含量为61.93%,共编码507个氨基酸,其氨基酸序列中不含信号肽结构。将spase克隆至表达质粒pET-22b(+),转化宿主后得到重组菌Escherichia coli Rosetta(DE3)(pET-22b/.spase)。SDS-PAGE电泳分析表明,经IPTG诱导后,宿主细胞在胞内成功表达了有活性的蛋白SPase,酶活为2.0 U/mg。选取Sec路径和Tat路径的信号肽各两条更换pelB信号肽,构建得到含不同信号肽的SPase表达载体的重组菌,发现更换的信号肽并不能使SPase分泌至胞外,对胞内酶活影响不大。由于不同来源的酶的酶学性质差异较大,我们随后将SPase纯化并研究其酶学性质。通过细胞裂解、盐析、Ni2+纯化得到电泳纯的重组SPase.酶学性质分析发现,重组酶的比酶活为40.38U/mg；最适反应温度为37-C,同时其热稳定性较差；最适反应pH为6.7,在pH 6.0-7.0下相对稳定；重组酶的Km为11.26mmol/L.Vmax为0.27μmol/(min·mg)。当反应条件为200 U/mL的重组SPase,氢醌浓度为5 mmol/L,氢醌与蔗糖摩尔比为1：5,pH为6.5,25℃水浴时,氢醌的转化率接近85%,α-熊果苷的摩尔产率为65%。通过酶学性质及其产α-熊果苷的研究发现,该酶可以得到较好的熊果苷产率。因此,有必要利用发酵优化的方式提高酶的产量。我们发现,通过摇瓶发酵条件优化,得到重组大肠杆菌SPase表达的最优发酵条件为：TB培养基,诱导剂IPTG度为0.4 mM,诱导温度为25℃,培养基起始pH为6.5。在此培养条件下,重组菌产SPase胞内酶活从2.0 U/mg提高到了7.0 U/mg。在3L罐上进行的发酵条件初步优化,发现初始甘油浓度为12g/L,诱导菌体浓度OD600为8时,重组菌产酶效果最好,最后通过甘油的补料分批培养,重组菌产胞内SPase酶活力达到了12.71 U/mg。