内生菌球毛壳ND35在寄主植物中的侵染过程及其定殖后对植物的影响与分子检测

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内生真菌球毛壳(Chaetomium globosum)ND35是从健康毛白杨中分离得到的优势内生菌株。本论文以ND35与毛白杨组培苗为试材,研究了ND35侵入寄主植物的过程及方式和促生机理;在大田条件下,针对107杨树苗等植物的抗病性和促生效果进行了初步研究,为今后生产中开发利用该生防菌株提供理论依据。分别用光学显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜等观察到, ND35接种杨树组培苗根部,10 h后菌丝紧密的附着在寄主表面并开始从细胞间隙侵入,主要是通过形成侵染钉穿透植物细胞壁并迅速侵染到寄主细胞内;在接种24 h后,ND35菌丝已侵入到根皮层细胞,接种48 h后,菌丝已侵入少数外皮层细胞。接种72 h后,毛壳ND35的菌丝侵入到多数外皮层细胞内部。并用球毛壳ND35的特异抗体结合TRITC荧光素标记检测球毛壳ND35菌丝在杨树组培苗根部的侵染和定殖。同时验证了制备球毛壳ND35抗体的特异性。ND35侵入到杨树组培苗内部组织后,对寄主植物产生显著影响。ND35接种杨树组培苗诱导的酶活性明显高于对照,接种第8天后过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性达到最高,分别为75.23 U·μg-1·min-1和3. 098 U·μg-1·min-1,比对照提高127.01%和194.44%。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性在接种后第4天达到最高,为2.339 U·μg-1·h-1,比对照提高241.46%;且经检测根系硝酸还原酶活力也显著提高,将组培苗移栽到温室1个月后,接种ND35的杨树苗的根系活力、叶绿素含量、根系长度及株高等方面都产生显著的影响。ND35菌株的发酵液经乙酸乙酯萃取,浓缩得黄褐色物质,用高效液相色谱(HPLC)检测到含有吲哚乙酸(IAA)和麦角甾醇等次生代谢物质,且试验表明麦角甾醇类物质能够促进植物的生长,从而为该菌株的促生机理的探讨提供依据。ND35定殖到大田杨树扦插苗内部组织后,能够促进植物的生长,使寄主植物的高和胸径生长、根系毛细根和须根的数量等指标都多于对照组。通过大田和室内试验还表明:毛壳ND35定殖到寄主内部后,提高了寄主植物对杨树腐烂病的抗性,拮抗效果分别达到70%、90.37%。并且对杨树的叶锈病也表现出拮抗效果,起到一定的防治作用。在毛壳ND35定殖到大田杨树扦插苗后的再分离试验中,当ND35定殖2个月后,ND35就能够在寄主植物的根、茎、叶等器官上分离出来,表明此时该菌株已侵染到寄主植物的叶部组织中;到10月份ND35的在根、茎、叶等器官上的再分利率达到90%左右。ND35接种到大田板栗(Castanea mollissima)实生苗后,也表现出促进植物生长的作用,在根系须根和毛细根的数量等方面与ND35接种到大田杨树扦插苗上的作用效果及再分离的结果上也基本相同。并且板栗实生苗接种ND35后,能够促进植物提前开花并且花序的数量也显著高于对照。从而为ND35促进寄主植物的生长提供理论依据。在本文中以杨树组培苗、大田杨树扦插苗为材料,采用CTAB法提取总DNA。以ITS通用引物和毛壳ND35的特异引物检测了ND35在寄主内部的定殖情况,结果表明在100bp有明显的亮带。应用PCR体系与设计的特异引物可用于球毛壳ND35在寄主植物中的定殖检测,为内生真菌的分子检测提供了新方法。
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