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目的:探讨应用shRNA敲减ILK后对人脑胶质瘤细胞U251增殖、迁移、侵袭及体外肿瘤形成的影响 实验方法: 1)应用shRNA发转染人脑胶质瘤细胞U251系后获得稳定转染细胞株; 为了明确已经从转录及翻译水平均稳定敲减ILK表达水平,实验采用RT-PCR、 Western blot分别测定转染前后U251人脑胶质瘤细胞中ILK的mRNA以及其蛋白表达情况; 2)shRNA-ILK对细胞增殖能力影响 ⑴应用CCK-8法检测定shRNA转染后细胞吸光度值改变,进而了解敲减ILK后对增殖速度的改变; ⑵流式细胞术(FCM)检测转染前后细胞增殖周期变化; ⑶免疫荧光法检测Ki67的表达水平;为了明确细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的转录及其蛋白表达水平,实验采用RT-PCR、Western blot分别检测。 3)shRNA-ILK对细胞迁移能力及侵袭能力影响 ⑴Transwell小室检测敲减ILK表达后,U251细胞迁移、侵袭能力的改变; ⑵免疫荧光法检测E-cadherin的表达;RT-PCR、Western blot分别检测E-cadherin、Snail转录及其蛋白表达情况; 4)人脑胶质瘤U251裸鼠移植瘤模型建立和观测。 实验结果: ⑴稳定转染的U251细胞ILK蛋白和mRNA表达水平明显下降; ⑵敲减ILK表达的U251细胞株增殖、迁移及侵袭能力降低;与增殖(Ki67、Cyclin D1)、迁移及侵袭(E-cadherin、Snail)相关的指标有明显变化,这些指标表达水平与对照组比较均有显著性差异(P<0.05); ⑶应用shRNA敲减ILK表达细胞株裸鼠成瘤能力明显降低。 结论:应用shRNA敲减ILK表达的U251胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及成瘤能力均显著降低,因此ILK可能是抑制胶质瘤的重要基因。