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研究背景多形红斑(erythema multiforme,EM)与 Steven-Johnson 综合征(Steven-Johnson syndrome,SJS)、中毒性表皮松解坏死症(Toxic epidermal necrolysis,TEN)既往曾被认为是同一个病谱性疾病的不同阶段。目前多数观点认为其为发病原因、临床表现及治疗方法均有不同的两种疾病,发病机制迄今尚未明确。组织病理上,EM与SJS/TEN均可出现表皮角质形成细胞凋亡。其中,EM凋亡的角质形成细胞数量少且更分散。目前,microRNAs是表观遗传学中的研究热点,已有大量研究证实其参与肿瘤及多种皮肤疾病的发病过程。但国内尚无参与EM、SJS/TEN发病机制的研究报道。因此,本研究旨在探讨是否有miRNAs对EM、SJS/TEN的发病产生影响,如果有,确认并探讨其在上述疾病中发挥作用的可能机制。研究目的探讨miRNAs在EM与SJS/TEN发病机制中的作用,并评估miRNA作为病情标志物的可能性。研究方法取2016年1月-2017年3月在山东省立医院皮肤科病房住院患者8例TEN,10例SJS,15例EM患者及22例健康志愿者的血清标本。同时取我科病理室15例病理诊断为多形红斑的组织标本,回顾其临床资料,其中TEN4例,SJS3例,EM8例。另外取4例银屑病,4例特应性皮炎及6例正常皮肤的组织标本。第一部分:多形红斑、中毒性表皮松解坏死症和Steven-Johnson综合征中差异表达miRNA的筛选1、初筛:从3例TEN患者的皮损组织中获取miRNAs,并用由372个miRNAs组成的PCR芯片将TEN患者皮损表达的miRNAs与3例健康皮肤组织表达的miRNAs进行比较。根据PCR芯片检测结果,与正常皮肤比较,TEN患者皮损中有1 5种miRNAs显著上调或下调。2、确定目标:用每个miRNA的特异引物并增加样本进行实时定量PCR分析(4例TEN患者,3例SJS患者,8例EM患者,4例银屑病患者,4例特应性皮炎患者,6例正常皮肤)验证PCR芯片检测结果。结果提示miR-1 8a-5p水平与EM及SJS/TEN病情严重程度相关。3、验证:进行原位杂交分别检测miR-18a-5p在正常皮肤、EM、TEN、银屑病及特应性皮炎皮损中的表达。第二部分:检测miR-18a-5p-BCL2L10-caspase通路在角质形成细胞凋亡过程中的作用1、进行正常人表皮角质形成细胞(Normal human epidermal keratinocytes,NHEKs)培养;分别用miR-18a-5p模拟物、抑制物转染NHEKs,分别用TUNEL和Annexin V法检测细胞凋亡。2、利用miRNA靶基因预测数据库检索miRNA-1 8a-5p的潜在靶点。根据在线数据库TargetScan、miRanda及microCosm,将BCL2L10作为miR-18a-5p的凋亡相关假定靶基因。为了证实miR-18a-5p与BCL2L10之间的联系,NHEKs用miR-18a-5p模拟物和miScript靶保护物转染,miScript靶保护物是在BC2L10mRNA 3’UTR上与miR-18a-5p结合位点互补的单链RNA;覆盖结合位点的侧翼区域并且特异性干扰miRNA与mRNA的直接相互作用。结果表明BCL2L10是miR-18a-5p的靶目标。3、应用荧光素酶报告基因技术进一步检测miR-18a-5p与BCL2L10 3’UTR的直接结合。该荧光素酶构建质粒含有野生型及点突变型BCL2L10 3 UTR,点突变型可使miR-18a-5p匹配突变。4、分别进行免疫组化及免疫印迹检测BCL2L10 mRNA和蛋白在EM及SJS、TEN患者皮损中的表达水平。5、首先用siRNA敲除BCL2L10的表达后转染NHEKs,用TUNEL法和Annexin V法检测细胞凋亡及内源性凋亡的关键蛋白酶caspase-9活性。其次进行免疫组化方法检测正常皮肤与TEN患者皮损中活性caspase-9的表达。最后检测miR-18a-5p模拟物、抑制物转染后的NHEKs内活性caspase-9及caspase-3的表达。第三部分:EM和SJS/TEN患者血清miR-18a-5p水平及与临床特征的相关性分析检测EM、SJS、TEN患者及健康对照组血清miR-18a-5p水平,其中EM、SJS、TEN患者血清miR-18a-5p水平与其临床数据(嗜酸性粒细胞计数、红斑BSA、糜烂BSA)进行相关性分析。本研究所使用的相关实验技术有miRNAs PCR芯片检测;实时PCR验证差异表达的miRNAs;原位杂交;NHEKs培养,分离石蜡包埋组织切片中的总RNA,从培养细胞中提取总RNA,cDNA合成;从组织切片中提取miRNA,从血清标本中分离miRNA;逆转录转染;荧光素酶报告基因检测;分别用TUNEL法和Annexin V法进行细胞凋亡检测;活性半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)测定;免疫组织化学染色;细胞裂解与免疫印迹检测;最后对所得数据进行统计分析。结果第一部分:多形红斑、中毒性表皮松解坏死症和Steven-Johnson综合征中差异表达miRNA的筛选1、初筛结果:PCR芯片检测结果,与正常皮肤相比,TEN患者皮损中有15种miRNAs显著上调或下调。2、确定目标miRNA:经实时定量PCR分析显示,发现TEN患者皮损中miRNA-18a-5p的表达显著上调;发现EM和SJS患者皮损中的miR-18a-5p水平与健康皮肤相比略有升高,但低于TEN组水平。提示miR-18a-5p水平与EM及SJS/TEN严重程度相关,为本课题研究对象。3、原位杂交结果:在EM和TEN患者皮损样本中miR-18a-5p的信号明显,且主要存在于表皮的凋亡细胞中;在正常皮肤、银屑病、特应性皮炎患者的皮损中均未发现miR-1 8a-5p表达。提示miR-18a-5p可能参与角质形成细胞凋亡。第二部分:检测miR-18a-5p-BCL2L10-caspase通路对在角质形成细胞凋亡过程中的作用1、用miR-18a-5p模拟物、抑制物转染NHEKs,分别用TUNEL和Annexin V法检测细胞凋亡。结果显示:miR-18a-5p模拟物在体外过度表达导致凋亡细胞的百分比增加,且增加有统计学意义。miR-1 8a-5p抑制物降低miR-18a-5p表达,但未减少NHEKs的凋亡。2、进一步研究miR-1 8a-5p与BCL2L10之间的联系。NHEKs用miR-18a-5p模拟物和miScript靶保护物转染。结果显示:miR-18a-5p模拟物显著降低了BCL2L10蛋白和mRNA的表达;在miScript靶保护物组,miR-18a-5p模拟物对BCL2L10表达的抑制作用减弱。提示BCL2L10是miR-18a-5p的靶目标。3、进一步使用荧光素酶报告基因技术检测miR-18a-5p与BCL2L10 3’UTR的直接结合。结果显示:野生型质粒的荧光素酶活性被miR-18a-5p模拟物降低;突变型质粒的荧光素酶活性则不受影响。显示miR-1 8a-5p与BCL2L10 3’UTR直接结合。4、检测BCL2L10mRNA和蛋白在正常皮肤与EM、SJS、TEN患者皮损中的表达。TEN患者皮损中BCL2L10mRNA水平与健康皮肤相比有显著降低。免疫印迹结果显示:TEN患者皮损中和蛋白水平与健康皮肤相比有显著降低。SJS和EM患者皮损中的BCL2L10水平也降低,但并不显著。免疫组化结果显示:正常皮肤表皮角质形成细胞核中可检测到BCL2L10蛋白表达,而在TEN患者表皮角质形成细胞中表达明显减少,EM患者表皮角质形成细胞中BCL2L10表达也有所下降。5、用siRNA敲除BCL2L10的表达后转染NHEKs;用TUNEL法和Annexin V法检测细胞凋亡及内源性凋亡的关键蛋白酶caspase-9活性。结果显示:敲除BCL2L10后,凋亡细胞数目显著增加,caspase-9的活性上调。进一步分别用免疫印迹和免疫组化方法检测活性caspase-9的表达,结果显示:敲除BCL2L10后,活性caspase-9表达增加;与健康皮肤相比,TEN患者表皮凋亡细胞强烈表达活性caspase-9。免疫印迹法检测用miR-18a-5p模拟物、抑制物转染后NHEKs内活性caspase-9及caspase-3的表达,结果显示:miR-18a-5p模拟物可诱导活性caspase-9及caspase-3的表达,miR-18a-5p抑制物不影响caspase的表达及活性。第三部分:EM和SJS/TEN患者血清miR-18a-5p水平及与临床特征的相关性分析从EM、SJS、TEN患者与健康对照血清标本中分离miRNA并测定其浓度,结果显示:TEN患者血清miR-18a-5p水平显著高于健康人,EM和SJS患者血清中miR-18a-5p水平略高于健康对照组,但差异无统计学意义。将EM、SJS、TEN患者血清miR-18a-5p水平与其临床数据(嗜酸性粒细胞计数、红斑BSA、糜烂BSA)进行相关性分析,结果显示:血清miR-18a-5p水平与嗜酸性粒细胞计数相关性无统计学意义(r =0.41,P=0.064),而与红斑BSA(R=0.60,P=0.003)和糜烂BSA相关性更高(r=0.71,P<0.001)。结论miR-18a-5p通过与BCL2L10 3’UTR结合下调其表达,可能通过激活caspase-9介导的内源性细胞凋亡通路在EM和SJS/TEN患者的角质形成细胞凋亡过程中起重要作用,其有可能作为新的病情标志物评估疾病的严重程度并指导用药。