目的　　探讨STAT3抑制剂反馈性激活EGFR及体内外联合大黄酸和EGFR抑制剂协同对结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移等活性研究。　　方法　　第一部分　　1.通过Western blot 检测STAT3小分子抑制剂（LY5）对结直肠癌细胞p-STAT3, p-EGFR (Y1068), p-ERK1/2, 和 p-AKT表达的影响。利用细胞划痕实验探索STAT3小分子抑制剂（LY5）及EGFR抑制剂（Erlotinib）单用或联用对结直肠癌HCT-116和DLD-1细胞系细胞迁移能力的影响。MTT实验检测STAT3抑制剂（LY5）与EGFR抑制剂（Erlotinib）单用或联用对HCT-116和DLD-1细胞生存率的抑制。　　2.大黄酸在化学结构上与已知的四个STAT3抑制剂Napabucasin、STA-21、LLL12和LY5的结构相似，利用STAT3 SH2结构域的分子对接模拟实验，计算机辅助的分子对接结果初步模拟显示大黄酸与STAT3蛋白之间的作用关系。　　3.在结直肠癌细胞株 HCT-116 和 SW-620 中，实验分四组（ DMSO/大黄酸/Erlotinib/Erlotinib+大黄酸），利用MTT实验检测IC50并计算生存率，表明大黄酸与EGFR抑制剂Erlotinib单用或联用对结直肠癌细胞生存率的影响，通过Western blot检测大黄酸对结直肠癌细胞p-STAT3表达的影响。　　4.利用流式周期实验探索大黄酸及EGFR抑制剂Erlotinib单用或联用对结直肠癌HCT-116和SW-620细胞系细胞周期的影响，检测ClinB1与 CDC2细胞周期阻滞相关蛋白的表达情况，在机制上阐述大黄酸和Erlotinib单用或联用对结直肠癌细胞的周期阻滞效应。　　5. 通过对结直肠癌细胞进行流式凋亡实验，检测早期凋亡和晚期凋亡比例作统计分析，利用Western blot 实验检测HCT-116细胞的凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平，反应大黄酸和Erlotinib 单用或联用对结肠癌细胞凋亡的诱导效果。　　6. 利用显微镜下观察HCT-116结肠癌细胞形态的变化情况及细胞集落实验考察大黄酸和Erlotinib单用或联用对HCT-116结直肠癌细胞细胞形变和集落形成能力的影响。　　第二部分　　1.构建裸鼠肿瘤模型，将实验裸鼠随机分成四组（对照组/大黄酸/Erlotinib/Erlotinib+大黄酸），给药期间拍照并记录裸鼠体重变化，肿瘤体积及质量，绘制相关曲线图。　　2.通过蛋白免疫印迹实验检测p-STAT3和p-EGFR及促凋亡蛋白Bax的表达，探究单药与联合给药在体内的抗肿瘤作用。　　3.通过比较裸鼠每组给药之前与给药之后的小鼠体重变化情况，及组织分析结果，评估大黄酸及Erlotinib联合给药后的安全性。　　结果　　1. Western blot实验检测p-STAT3，p-EGFR (Y1068), p-ERK1/2, 和 p-AKT,发现结直肠癌细胞中LY5作为STAT3抑制剂，也可以诱导EGFR磷酸化增加，进而激活EGFR信号通路。细胞划痕实验证明STAT3抑制剂（LY5）及EGFR抑制剂（Erlotinib）联用明显抑制结直肠癌HCT-116和DLD-1细胞系细胞迁移能力，差异存在统计学意义（P<0.05）。MTT实验表明联用STAT3抑制剂（LY5）与EGFR抑制剂（Erlotinib）对HCT-116和DLD-1细胞生存存在明显抑制，差异存在统计学意义（P<0.05）。　　2.分子对接模拟实验结果显示大黄酸可能与STAT3蛋白直接结合并影响其Y705磷酸化活性位点。　　3.从分子细胞层面上，通过Western blot 检测p-STAT3(Y705)结果显示大黄酸能抑制结直肠癌细胞STAT3的磷酸化激活，从而抑制结直肠癌细胞增殖和促进凋亡。根据 MTT 实验也发现，大黄酸可剂量依赖性地抑制结直肠癌细胞的生长。Erlotinib作为EGFR抑制剂，联合大黄酸，对结直肠癌细胞的抑制活性明显优于两者单独用药，且差异存在统计学意义（P<0.05）。细胞周期实验表明，两药协同显著增强细胞G2/M期的阻滞作用，下调ClinB1与 CDC2细胞周期阻滞相关蛋白的表达，进一步证实大黄酸和Erlotinib联合较单用对结直肠癌细胞的周期阻滞效应增强，差异存在统计学意义（P<0.05）。流式细胞凋亡结果及Western blot表明大黄酸可促结直肠癌细胞系凋亡，联合用药的细胞凋亡率及下调Bcl-2 的表达水平明显优于单纯给药，证明大黄酸联合Erlotinib可协同诱导结直肠癌细胞的凋亡，差异存在统计学意义（P<0.05）。大黄酸可抑制 HCT-116 细胞集落形成及促使细胞形态改变。结果证实在结直肠癌细胞系中联合EGFR抑制剂（Erlotinib）和大黄酸比单独使用抑制剂能明显减弱细胞活力。　　4.裸鼠体内实验上进一步研究质量结果图发现单独给药组大黄酸和Erlotinib体重增长缓慢，肿瘤质量较对照组减轻，联合给药组体积及质量明显低于对照组及单药组，提示联合用药可显著抑制肿瘤增长，裸鼠的肿瘤Western blot证实联合用药上调促凋亡蛋白Bax的表达水平，较单纯用药明显抑制p-STAT3和p-EGFR的表达。组织分析结果提示联合给药对小鼠的正常组织（心脏、肝脏及肾脏）无明显毒性。　　结论　　1.在分子及细胞层面发现 STAT3 抑制剂能反馈性激活 EGFR 信号通路，联合STAT3和EGFR的抑制剂发挥协同抗肿瘤作用。　　2.新型STAT3抑制剂大黄酸具有较好的抗肿瘤活性，基于大黄酸与STAT3分子模拟对接，STAT3可能是大黄酸的直接作用靶点。　　3.在细胞学水平上发现大黄酸抑制STAT3发挥抗肿瘤效果，及增敏EGFR抑制剂抑制细胞活力。以及大黄酸和EGFR抑制剂联用协同促进细胞凋亡和抑制细胞增殖。　　4.在动物层面同样说明大黄酸和EGFR抑制剂具有很好的协同抗肿瘤作用，大黄酸能有效逆转EGFR抑制剂耐药以及具有良好的安全性。