小白菊内酯对人肝癌细胞HepG-2影响的实验研究

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目的:研究小白菊内酯对人肝癌细胞HepG-2增殖抑制和诱导凋亡作用及其抗迁移影响的作用机制。为小白菊内酯在临床上早日应用于肝癌患者提供理论及实验依据。方法:用体外培养的方法培养人肝癌HepG-2细胞;用四唑盐(MTT)比色法检测小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞的抗增殖及细胞毒作用;用倒置显微镜、HE染色光学显微镜、荧光显微镜等观察小白菊内酯作用人肝癌HepG-2细胞前后细胞形态学的改变;用流式细胞仪技术检测药物作用前后细胞周期的改变和细胞凋亡的情况;用免疫组织化学染色法检测小白菊内酯作用人肝癌HepG-2前后NF-κB蛋白阳性表达变化的情况;用细胞划痕实验的方法研究对照组和加药组肿瘤细胞的迁移情况。通过以上实验研究小白菊内酯在体外对人肝癌HepG-2在细胞增殖、细胞凋亡及肿瘤细胞迁移等方面的影响及其作用机制。结果:(1)MTT法结果显示:小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞的作用影响具有浓度和时间依赖性;(2)细胞形态学观察:倒置显微镜观察到对照组细胞贴壁生长,伸展性良好,细胞呈梭形和多角形,细胞之间连接紧密。小白菊内酯作用人肝癌HepG-224h以后,增殖速度减慢,细胞贴壁能力下降,细胞之间连接疏松,小部分细胞变圆漂浮在培养瓶中。药物作用48h以后,增殖速度大大减慢,大部分细胞变圆漂浮在培养瓶中。药物作用72h以后,几乎无活细胞,并且可见死细胞碎片;HE染色光学显微镜下观察:对照组细胞呈梭形和多角形,细胞之间连接紧密,细胞胞浆丰富,细胞核完整;药物作用24h以后,细胞伸展减弱,有一部分细胞呈现圆形,细胞之间连接疏松,核浓缩,染色质出现边聚;药物作用48h后视野中可见凋亡细胞和死亡细胞,细胞浆浓缩、染色质浓缩成新月形和“出泡”现象的变化;AO/EB双染色荧光显微镜下观察:对照组细胞核染色质呈现绿色,并且染色质结构正常。药物作用细胞24h以后,细胞核染色质呈现绿色或者黄绿色,部分细胞核染色质呈现圆柱状或者固缩状,为早期凋亡细胞;药物作用细胞48h以后,部分细胞核染色质呈现橘红色,并且细胞核染色质呈现圆柱状或者固缩状,为晚期凋亡细胞。药物作用细胞72h以后,大部分细胞核染色质呈现橘红色,而且出现了坏死细胞,坏死细胞呈现红色,染色质发生了浓缩、碎裂;Hoechst33258染色荧光显微镜观察:对照组细胞呈现微弱的蓝色荧光;当小白菊内酯作用人肝癌HepG-248h以后,细胞染色呈现强蓝色荧光;(3)免疫组化结果显示:实验组Caspase-3表达增加,NF-кB表达降低,这与对照组相比具有显著性差异(P<0.05);(4)流式细胞仪结果显示:药物作用以后细胞周期中G0/G1期细胞数增多,S期和G2/M期细胞数减少,说明经药物作用以后人肝癌HepG-2细胞株被阻滞在G0/G1期。(5)细胞划痕实验显微镜下观察发现:对照组细胞伸展性良好,细胞呈梭形和多角形,细胞之间连接紧密,六孔板中间划痕上没有细胞。48h后,对照组通过细胞迁移,中间划痕距离缩小,大部分被细胞覆盖,修复,而加药组细胞药物作用48h以后,由于其药物抑制了肿瘤细胞的迁移,并没有将划痕掩盖住。结论:1.小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞有明显的抑制增殖作用,呈现出浓度和时间的依赖性,药物将细胞阻滞在G0/G1期;2小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞株有诱导凋亡作用,其诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡机制可能与NF-kB、Caspase-3等信号转导有关;3.小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞株有抗迁移作用;4.小白菊内酯具有多种途径的抗肿瘤作用,这也说明此中药值得我们今后更进一步的研究。
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