论文部分内容阅读
腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)是肾衰竭治疗的主要方法之一,而腹膜纤维化(Peritoneal fibrosis,PF)是导致很多患者腹膜透析失败的重要因素,腹膜上皮细胞向间充质细胞的转分化(ePithelial-mesenchymal-transitions,EMT)是腹膜纤维化的主要过程。前期实验表明,硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate,IS)可以诱导腹膜间皮细胞发生转分化,但是β-catenin是否参与尚未明确,本课题主要对IS导致EMT过程进行更多的研究,明确β-catenin分子是否参与腹膜间皮细胞发生转分化,并使用β-catenin小分子抑制剂(ICG-001)干预,观察其是否可以改善EMT,旨在发现腹膜纤维化更多的发生机制,为腹膜纤维化的干预发现更多方法。【目的】1.体外培养人腹膜间皮细胞(HMrSV5),用IS刺激HMrSV5细胞,4.25%葡萄糖腹膜透析液(PDF)作为阳性对照,通过显微镜观察细胞形态学变化情况,检测E-cadherin、β-catenin、α-SMA的表达情况;2.对上述IS和PDF干预的细胞组分别加入β-catenin小分子抑制剂(ICG-001),检测上述分子的表达情况,观察其对腹膜间皮细胞EMT的影响,探讨β-catenin分子是否参与EMT发生的过程,ICG-001可否逆转EMT;3.利用细胞功能实验:细胞基质粘附实验和CCK-8,检测不同分组细胞的粘附能力和增殖能力,进一步验证IS是否导致腹膜间皮细胞发生EMT;【方法】1.将体外培养的HMrSV5细胞,进行传代后分成5组:(1)对照组(DM):只用培养液处理细胞;(2)IS组:用含1000umol/的IS处理细胞;(3)用含5umol/L ICG-001+1000umol/L浓度的IS共同处理细胞;(4)用含5umol/L ICG-001+4.25%腹膜透析液共同处理细胞;(5)PDF(Peritoneal dialysis fluid,腹膜透析液)组:加4.25%腹膜透析液处理细胞。2.对以上5个分组细胞培养至0h、12h、24h、48h、72h后,用显微镜观察5组细胞的形态变化,用RT-qPCR方法测得各组各时间点E-cadherin、β-catenin、α-SMA基因相对表达量,用Western blot方法测定各组各时间点Ecadherin、β-catenin、α-SMA蛋白的表达情况;3.通过细胞功能实验:细胞基质粘附实验和CCK-8实验,分别检测各组细胞粘附能力和增殖活性;【结果】1.与对照组(培养液组)相比较,经IS剌激细胞后,细胞变细变长、呈梭形改变,而加用β-catenin抑制剂(ICG-001)干预后,细胞的形态变化不明显。2.对照组(培养液组)的细胞β-catenin、α-SMA几乎没有表达,经IS、PDF刺激细胞24小时后,β-catenin、α-SMA的表达明显上调;而E-cadherin在对照组高表达,在IS组和PDF组的表达从24h开始至72h逐渐下降,差别显著,有统计学意义(P<0.05);3.与IS组及PDF组相比,对应的β-catenin抑制剂组在24h、48h、72h时间点,E-cadherin的表达较前上升、β-catenin、α-SMA的表达有所下降,差别显著,有统计学意义(P<0.05);4.细胞基质粘附实验结果显示,在48h检测结果发现,与正常对照组比较,IS和PDF组粘附细胞个数明显增加,而IS/PDF+ICG-001组观察到的粘附细胞显著减少,有统计学意义,(P<0.0001);5.CCK-8实验结果显示,在72小时,IS和PDF组和正常对照组比较,在450nm吸收光下测得的OD值明显增加,而IS/PDF+ICG-001组检测得到的OD值较前者有所下降,差别显著,有统计学意义(P<0.0001);【结论】1.用IS刺激腹膜间皮细胞使细胞形态学发生改变;细胞功能实验显示:IS刺激后的腹膜间皮细胞,细胞-基质粘附能力显著增加、细胞的增殖能力也相应增加。同时α-SMA的基因和蛋白水平上调,E-cadherin基因和蛋白水平下调,表明IS可以诱导腹膜间皮细胞发生EMT。2.IS刺激腹膜间皮细胞发生EMT过程中,β-catenin的表达明显上调。使用β-catenin抑制剂后,β-catenin、α-SMA表达下降,E-cadherin的表达上升,细胞-基质粘附能力和增殖活性降低,进一步表明β-catenin参与了IS诱导腹膜间皮细胞发生EMT过程。