论文部分内容阅读
恶性肿瘤是人类死亡的主要因素,其中“癌中之王”-胰腺癌,属于恶性程度高、进展迅速的消化道肿瘤,由于缺乏特异性症状及生物标志物、活检难、预后差等因素,致使其死亡率与发病率将近持平。女性中乳腺癌发病率持续增高,而作为该亚型之一的三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）,进展快、复发早、预后差,并且缺乏孕激素、雌激素及人类表皮生长因子的相应受体,使得其医治困难,成为乳腺癌的治疗难点。天然产物因其来源广泛、结构多样、生物活性较强、毒副作用低及靶点广泛、作用机制独特等优势,已成为抗肿瘤药物研发的主要来源。桑全株均有药用价值;从桑科桑属植物中分离鉴定到的Diels-Alder型加合物结构新颖并伴随着抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种生物学活性。Chalcomoracin（CMR）和Guangsangon E（GSE）是从桑中分离提取出来的两种Diels-Alder型加合物,具有显著的抗肿瘤活性,但关于其抗胰腺癌和TNBC的药效及其药理机制尚不清楚。本论文通过生物信息学结合分子药理学手段,对Diels-Alder型加合物CMR和GSE抗肿瘤药效及其药理作用机制进行了深入探究,以期为Diels-Alder型加合物的开发利用奠定基础,也为胰腺癌及TNBC新药研发提供新思路,主要内容和结果如下:（1）CMR及GSE体内外抗肿瘤药效学研究通过MTT、平板克隆、Wound healing、流式细胞术、Western blot等研究手段,开展了CMR及GSE体内外抗肿瘤药效学研究,结果表明PANC-1细胞比A549和MDA-MB-453细胞对CMR更敏感;进一步研究发现,CMR可抑制胰腺肿瘤细胞PANC-1增殖、影响细胞周期的G0/G1期,限制异种移植瘤生长。GSE可抑制TNBC细胞株（MDA-MB-231、MDA-MB-453和MDA-MB-468细胞）的生长,显著降低异种移植瘤的大小和重量。（2）基于细胞及异种移植瘤模型研究CMR抗胰腺肿瘤的药理作用机制通过转录组学结合生物信息学分析,预测了CMR潜在作用机制,并利用MTT、Colony forming、Western blot、Plasmid transfection、Confocal、Flow cytometry等进行实验验证。转录组学分析预测CMR可引起PANC-1细胞自噬;药理实验结果表明,CMR诱导自噬,增加自噬通量,同时增强溶酶体酸化,并促进自噬体溶酶体融合。在CMR处理下,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路呈剂量和时间依赖性下调,诱导自噬。值得注意的是,CMR诱导PANC-1细胞凋亡,而Wortmannin（WM）或Atg5/Atg7基因敲低引起的自噬损伤可减少CMR触发的PANC-1细胞凋亡和生长抑制,从而提示自噬是凋亡的上游。此外,mTOR信号通路抑制、自噬介导的细胞凋亡及其所引起的细胞生长抑制均可被N-乙酰半胱氨酸（NAC;抗氧化剂）逆转,表明CMR通过活性氧（ROS）累积来抑制mTOR通路进而诱导自噬并触发细胞凋亡。体内实验数据（CMR体内抑瘤活性评价实验、干扰ROS生成对CMR体内抑瘤活性影响评价实验、干扰Atg7对CMR体内抑瘤活性影响评价实验）验证了体外数据。这些研究表明,CMR是一种新的自噬诱导物和潜在的抗胰腺癌先导化合物。（3）CMR对胰腺肿瘤细胞Wnt/β-Catenin信号通路的影响及其与mTOR信号通路间的级联关系采用MTT、Western blot、qRT-PCR、Confocal等手段,探讨CMR对胰腺肿瘤细胞Wnt/β-Catenin信号通路的影响。结果显示,CMR可有效抑制其Wnt/β-Catenin信号通路;利用MTT、Western blot等实验,进一步探究由CMR诱导的Wnt/β-Catenin信号通路与自噬、与mTOR信号通路间的关系,发现CMR诱导的Wnt/β-Catenin信号通路位于mTOR信号通路上游,即CMR通过抑制Wnt/β-Catenin信号通路进而抑制mTOR信号通路,诱导自噬,干扰细胞活力。（4）基于细胞及异种移植瘤模型研究GSE抗TNBC药理作用机制采用Western blot、Confocal、Transmission electron microscope、MTT、Flow cytometry等手段研究GSE对TNBC凋亡、自噬、线粒体功能及线粒体自噬的影响,并考察了胞内ROS水平及其与线粒体自噬之间的相关性。体内外研究结果显示,GSE诱导TNBC线粒体功能障碍,包括膜电位丧失、线粒体分裂,最终导致与线粒体自噬相关的非凋亡性细胞死亡,且其诱导的线粒体自噬与ROS累积有关,表明GSE是一种潜在的抗TNBC先导化合物。