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研究目的:本研究利用RNAi技术,通过体外试验探讨HPV16 E6、E7的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)对宫颈癌细胞生长的影响及干扰后一些功能指标的变化,以期为宫颈癌的治疗提供一个新的特异性基因治疗手段,同时为RNAi应用于临床奠定理论基础。方法:实验分为四组:转染HPV16E6 siRNA组、转染HPV16E7 siRNA组、转染HPV16E6 +E7 siRNA组(三个实验组)及对照组。1.将化学合成的针对HPV16 E6、E7的小干扰RNA (siRNA) ,采用脂质体分别转染及两者混合后转染HPV16阳性的宫颈癌CaSki细胞和Siha细胞,应用MTT法测定细胞活力及细胞生长抑制率;采用流式细胞术(FCM)检测HPV16 E6 siRNA、HPV16 E7 siRNA及两者混合后对宫颈癌CaSki细胞和Siha细胞凋亡的影响及转染后不同时间点细胞周期的变化。2. RT-PCR和Western Blotting检测HPV16 E6 siRNA、HPV16 E7 siRNA及HPV16 E6+E7 siRNA转染前后细胞中p53、Rb的mRNA及蛋白表达的变化。结果:1 .HPV16 E6、E7 siRNA及HPV16 E6+E7 siRNA转染CaSki和Siha细胞后,细胞生长明显受到抑制,细胞活力下降,FCM检测结果显示,转染后48 h细胞凋亡率,CaSki分别为29.5%、41.3%及45.9%,Siha分别为40.7%、40.3%及63.7%,两株细胞的三个实验组明显高于对照组(p<0.05);细胞周期分析显示三个实验组均将细胞阻滞在G1期。2. RT-PCR检测结果显示:三个实验组p53, Rb mRNA的表达与对照组相比差异无统计学意义(p>0.05)。3. Western Blotting检测结果显示:E6 siRNA转染后48 h,p53、Rb蛋白表达上调,p53上调的幅度大于Rb; E7 siRNA转染后48 h,p53、Rb蛋白表达上调,Rb上调的幅度大于p53; E6+E7 siRNA转染后48 h,Siha细胞中p53、Rb蛋白明显表达上调,CaSki细胞未检测出p53、Rb蛋白的表达。结论:1.HPV16 E6 siRNA、E7 siRNA及E6+E7 siRNA均可抑制宫颈癌细胞CaSki和Siha增殖,诱导凋亡,且E6+E7 siRNA的作用大于E6 siRNA、E7 siRNA的单独作用,有协同效应。RNAi技术可为HPV感染相关性疾病提供一种新的特异性基因治疗方法。2.在Siha细胞株,E6 siRNA通过上调p53蛋白发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用,E7 siRNA则主要通过上调Rb蛋白发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用,两者发挥作用的同时有交叉,即E6 siRNA可上调Rb, E7 siRNA也可上调p53。