先天性缺陷,急性损伤,神经外科手术和肿瘤的切除都将可能导致颅骨的大段骨缺损,由于大面积颅骨缺损在2岁以后很难再自行修复,同时由于美观和保护脑组织的需要,颅骨缺损的修复就显得非常重要。传统的治疗颅骨缺损的手段主要有骨移植和金属材料的填充等。但这些方法存在组织来源不足,免疫排斥反应,降解吸收差等缺点,使临床使用受限。为了解决以上问题,骨组织工程成为了目前研究的重点。本课题旨在构建一种新型组织工程化骨用于修复颅骨极量骨缺损,所采用的种子细胞是外周血间充质干细胞,支架材料是自聚合肽纳米纤维材料和聚乳酸-聚羟基乙酸。本课题首次证明了外周血间充质干细胞能在体内外进行成骨分化、首次构建了具有仿生结构特点的颅骨修复组织工程材料、该材料能支持干细胞在体内长期存活并形成新的骨质以促进骨修复。目前骨组织工程中研究的最多且最热门的种子细胞是间充质干细胞,它具有多向分化潜能、并较容易向成骨方向诱导、增殖能力强、且对各种组织具有较好的修复效果等优点。间充质干细胞一般从骨髓分离获得,但是从骨髓中获取间充质干细胞时难免会造成患者痛苦,组织损伤,局部感染可能以及增加患者治疗费用,加重患者经济负担,这些均限制了其在基础研究及临床上的应用。相对而言,外周血间充质干细胞(Pperipheral blood derived mesenchymal stem cells,PBMSCs),具有取材便利,易于从患者自身血液中获得,可避免免疫排斥以及伦理道德的问题等优点,而获得越来越多的关注和研究。自聚合肽纳米纤维材料(Sself-assembling peptide nanofiber scaffold, SAPSAPNS)是一种新型纳米纤维材料,已有报道证实它能够在多种组织修复中发挥良好的作用,被认为是组织损伤修复的研究中非常具有应用前景的生物材料。对比其他骨组织工程支架材料SAPNS具有较多优势：其多肽纤维直径为纳米级,结构与细胞外基质非常接近,能为生长在其中的细胞提供真正的三维纳米微环境。无细胞毒性,且具有极好的组织相容性,可降解性,且降解产物易于吸收。此外,该材料对损伤部位具有良好的止血效果。无明显的免疫排斥反应和炎症反应。聚乳酸-聚羟基乙酸(Ppolylactic-co-glycolic acid, PLGA)作为第一批可降解吸收材料被美国FDA批准用于临床,是迄今研究最广泛、应用最多的可降解生物材料。本实验中我们充分利用PLGA材料的可降解性,易于营养物质的渗透及一定的机械强度等特性,将其制成多孔PLGA膜,用以封闭的骨缺损部位,可避免脑组织暴露在外的危害,且能为SAPSAPNS水凝胶提供机械支撑,为的PBMSCs存活和成骨分化以及促进新骨形成的创造了良好的条件。本课题采用的主要方法如下：1.PBMSCs成骨分化潜能检测：第5代PBMSCs以每个爬片1×104个细胞的密度种植于24孔板中,基础培养液培养12h后进行成骨细胞诱导实验。成骨分化液由10-8M地塞米松,10mMβ-甘油磷酸钠,50mM抗坏血酸-2-磷酸和5×10-8M 1,25-二羟基维生素D3组成。诱导21d。随后进行碱性磷酸酶染色,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次,4%多聚甲醛固定5min,双蒸水冲洗3次,取2-3滴10μL碱性磷酸酶染色24h。von kossa染色,PBS冲洗2次,4%多聚甲醛固定5min,双蒸水冲洗3次,5%硝酸银溶液1m1,紫外灯下照射1h,5%硫代硫酸钠溶液1ml中和。茜素红染色,PBS冲洗2次,4%多聚甲醛固定5min,双蒸水冲洗3次,0.1%茜素红染液,染色30min。骨钙蛋白免疫荧光染色,PBS冲洗2次,4%多聚甲醛固定5min,双蒸水冲洗3次,10%正常山羊血清工作液封闭1h,分别加入骨钙蛋白一抗(1：400),Alexa568山羊抗小鼠荧光二抗(1：200)孵育,荧光封片剂进行封片,荧光显微镜下观察并拍照。2.PBMSCs在体外自聚合肽三维支架材料上成骨分化：1×104个第5代的PBMSCs(悬于DMEM培养液中),快速与50μL1%SAPNS溶液混合后植入培养皿中,并添加成骨诱导液。诱导培养21d,平均每1-2d更换1次培养液。诱导后的培养物被4%多聚甲醛中固定2h,30%蔗糖液冷冻脱水12h, OCT包埋剂包埋,最后制成冰冻切片(50μm)。然后这些切片标本被用来进行碱性磷酸酶染色,硫酸软骨素免疫荧光染色以及骨钙蛋白免疫荧光染色。3.颅骨组织工程移植物的制备：500μm厚的多孔的PLGA膜制备,首先0.5g85:15 PLGA溶解于10g二氯甲烷,然后添加入直径75-95μm的0.5g NaCl微粒,最后快速的倒入一个镀聚四氟乙烯的横向的模具中。在通风橱中蒸发48h之后用清水彻底去除氯化钠颗粒。然后,将多孔膜剪成直径为8mm的圆盘形,浸泡在75%的酒精中消毒过夜,用生理盐水冲洗3次,进而形成可用于最后移植的多孔PLGA膜。将GFP转基因大鼠来源的PBMSCs与SAPNS的混合物用两层多孔PLGA膜夹合制成三明治样结构,置于培养皿中成骨诱导7d,随后添加10μg/mL5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)于培养皿中再孵育48h。4.动物模型及移植：成年雄性SD大鼠(体重220-250g)经1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40mg/kg, IP)。在无菌条件下,从头皮正中切开,以便充分暴露颅顶骨。利用无菌颅钻在头顶中部制造出一个直径为8mm的极量颅骨缺损。将上述准备好的PMBSCs/SAPSAPNS/PLGA移植材料植入到骨缺损的部位。生物胶水黏合,逐层缝合切口。作为对照组,SAPNS/PLGA复合支架组进行了完全相同的培养条件和相同的植入过程。PBMSCs/SAPNS/PLGA复合支架组共12只大鼠,SAPNS/PLGA复合支架组共8只大鼠。术后按照实验动物中心的饲养方法。术后观察大鼠头部伤口均愈合良好。5.影像学和组织学检测骨组织再生：术后12w,动物过量麻醉处死,取材,利用咬骨钳小心分离颅骨标本(每组8只),用4%多聚甲醛固定48h。首先肉眼观察移植物与宿主骨的接合情况以及骨缺损部位新骨生长情况。观察标本纵切面,以便进一步了解骨缺损部位新骨的生成和移植物与宿主骨的黏合情况。Micro-CT扫描检测骨缺损部位的骨质形成情况并进行三维重建。通过Micro-CT扫描设备自带的软件对骨密度(Bbone mineral density, BMD)和骨体积(Bbone volume, BV)进行定量分析。Micro-CT扫描检测之后,标本经EDTA脱钙液进行脱钙,酒精脱水,石蜡包埋,随后常规石蜡切片,并进行HE染色等处理。骨质形成面积使用Image Pro Plus软件进行定量计算。6.免疫组化检测PBMSCs在体内存活以及成骨分化：4只PBMSCs/SAPSAPNS/PLGA组大鼠于移植2w后取材,将骨缺损部位取材后的移植物标本进行冰冻切片。随后进行骨钙蛋白免疫荧光染色,通过绿色荧光蛋白(GFP)信号检测移植细胞的存活及其与骨钙蛋白双标记检测其成骨分化。由于GFP表达自然下降,在PBMSCs植入体内12w后,GFP荧光信号逐渐消失,特别是标本通过脱钙,脱水,脱蜡等处理后很难通过GFP免疫组化检测到移植的细胞。所以我们采用BrdU免疫组化染色检测移植细胞在体内的长期存活,以及HE染色共定位检测移植细胞参与骨修复的情况。7.统计学分析：对数据采用SPSS20.0进行处理,数值以均数±标准差(X±SD)表示。数据比较使用t检验,p<0.05时差异具有显著性意义。主要结果：1.体外成骨诱导分化实验证明,外周血中提取出的间充质干细胞具有良好的向成骨细胞分化的潜能。2.SAPNS能支持PMBSCs在三维环境下生长、存活及向成骨细胞分化。3. Micro-CT扫描结果显示PMBSCs/SAPSAPNS/PLGA移植组骨缺损修复效果明显优于SAPSAPNS/PLGA移植组,且BMD和BV定量检测发现PMBSCs/SAPSAPNS/PLGA移植组高于SAPSAPNS/PLGA移植组,且差异具有统计学意义。4.HE染色结果显示PMBSCs/SAPSAPNS/PLGA移植组骨缺损部位骨质生成量明显高于SAPSAPNS/PLGA移植组。成骨面积定量检测结果显示PMBSCs/SAPSAPNS/PLGA移植组大于SAPSAPNS/PLGA移植组,且差异具有统计学意义。5.通过分别对2w和12w移植细胞的存活情况进行检测,结果显示2w时移植细胞在颅骨缺损部位生长良好且绝大部分已向成骨细胞分化,12w时移植细胞在颅骨缺损部位存活且能促进骨质生成。结论：本实验成功的证明了从外周血中提取出的间充质干细胞可用作骨组织工程的种子细胞,具有良好的临床应用前景。PBMSCs/SAPNS/PLGA复合支架材料能模拟颅骨板障样结构,有利于修复极限颅骨缺损,其中SAPNS可支持PBMSCs在三维条件下存活及成骨分化。本研究首次通过GFP和BrdU标记的方法证实了PBMSCs能在体内长期存活并提供了它们能直接参与骨质再生的证据。