研究目的:肝癌和黑色素瘤是高度恶性的肿瘤。为了研究Pin1在这两种肿瘤中的调控功能,我们通过观察Pin1敲减后的蛋白质底物、细胞生物学行为、动物活体荷瘤等变化,探讨Pin1通过影响其下游底物进而影响肿瘤发生发展的机制;进一步地,通过Pin1抑制剂全反式维甲酸ATRA对黑色素瘤和肝癌生长的抑制作用,为未来在临床上ATRA治疗实体瘤奠定理论和实验基础。研究方法:1.研究Pin1对恶性肿瘤功能的影响。包装Pin1-Sh RNA的慢病毒,通过感染Pin1敲减的慢病毒,构建稳转株细胞系,用生长曲线和平板克隆测定增殖能力的变化,用划痕和Transwell测定迁移和侵袭的变化。2.在活体动物水平上通过裸鼠体内成瘤方法测定Pin1对恶性肿瘤成瘤能力和成瘤率的影响,通过尾静脉注射裸鼠检测Pin1对黑色素瘤转移能力的影响。3.探讨Pin1对恶性肿瘤功能影响的机制。通过Western-blot检测部分Pin1作用的下游底物蛋白,寻找引起恶性肿瘤功能的机理。通过感染敲减相应的底物的病毒进行生长曲线的测定、划痕实验、Transwell测定,以及进行恢复实验测定生长能力变化等进一步验证机理是否正确。同时用流式细胞术对Pin1调控肿瘤干细胞机理进行验证。4.利用Pin1的抑制剂进行药物治疗的研究,在细胞水平上进行生长曲线的测定,利用Transwell进行增殖能力的测定,通过裸鼠体内肿瘤移植实验对肿瘤成瘤能力的测定。研究结果:1.敲减Pin1以后在细胞学行为上对黑色素瘤、肝癌都发生了较大的影响。Pin1敲减以后肿瘤细胞的形态发生变化。从生长曲线上看Pin1敲减以后,生长能力明显下降。平板克隆的结果显示,Pin1对恶性肿瘤增殖能力有很强的抑制作用。而划痕和Transwell的结果显示,Pin1能明显地抑制恶性肿瘤细胞的迁移和侵袭的作用。2.在动物水平上通过测定皮下移植敲减Pin1的黑色素瘤细胞后,肿瘤的体积以及重量的变化,结果显示Pin1敲减以后,肿瘤的体积和重量明显下降。而尾静脉注射以后,通过小鼠活体成像的荧光结果显示,Pin1敲减以后黑色素瘤高转移细胞的转移能力明显下降。3.通过Western-blot检测Pin1作用的底物蛋白分子,结果显示Pin1敲减以后在黑色素瘤中Notch1的变化最为明显。同时通过敲减Notch1进行体外实验,结果显示与敲减Pin1的结果相似。而在恢复实验中可明显观察到过表达Notch1可以恢复Pin1敲减所带来的生长抑制能力及迁移能力。同时进行流式细胞术对黑色素瘤表面蛋白的检测结果显示,Pin1敲减以后,黑色素瘤的干细胞数目明显下降。而肝癌细胞中Pin1可以通过多个下游靶点发生变化,从而影响肝癌的生长4.在用Pin1的抑制剂对恶性肿瘤进行治疗时,从生长曲线上看,黑色素瘤细胞的增殖能力下降,同时从Transwell上看黑色素瘤的迁移能力明显受到抑制,从流式细胞术上看,抑制剂抑制了黑色素瘤的干细胞。对于肝癌细胞株,一株细胞需要Liarozole来维持抑制剂的稳定性才能抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力。而在裸鼠体内成瘤能力的检测中发现,Pin1的抑制剂能够明显的抑制黑色素瘤的体积并且呈剂量依赖性。结论:5.Pin1在体外能明显的抑制恶性肿瘤中黑色素瘤和肝癌增值能力、迁移和侵袭能力;Pin1在活体动物水平上能明显的抑制黑色素瘤和肝癌细胞的成瘤能力以及黑色素瘤的转移能力;Pin1是黑色素瘤和肝癌治疗的重要靶标。6.Pin1能引起功能变化的机理为在黑色素瘤中Pin1是通过抑制其下游的Notch1信号途径来抑制肿瘤干细胞,从而引起黑色素瘤功能发生变化。在肝癌中Pin1是通过抑制其下游的多个致癌基因来抑制肿瘤的引起其功能变化。7.Pin1的抑制剂能抑制恶性肿瘤细胞的增值和迁移,以及黑色素瘤干细胞的数目,而且对恶性肿瘤的成瘤能力和黑色素瘤的转移能力也有明显的抑制作用。Pin1抑制剂有望进一步开发成临床药物。