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随着规模化、集约化饲养方式的普及,现代牧业中高产奶牛疾病的疾病增多明显,严重危害奶牛业健康发展,而奶牛亚急性瘤胃酸中毒(SARA)是高产奶牛的常见疾病,每年造成巨大损失。奶牛亚急性瘤胃酸中毒时,瘤胃内产生的大量组胺是导致奶牛产生各种炎症的重要因素。炎性因子COX-2、IL-6、TNF-α及NF-κB信号通路与炎症的产生密切相关。为研究奶牛瘤胃酸中毒时血液内组胺浓度的变化及对奶牛炎性因子及炎性信号通路的影响,本试验通过对健康奶牛饲喂高精料日粮,诱发亚急性瘤胃酸中毒,促使瘤胃内大量产生组胺,手术安装血管瘘管采集门静脉和肝静脉血液样品,通过检测血液中组胺含量及COX-2含量,并通过RT-PCR对在体肝脏中的COX-2、NF-κB、IL-6、TNF-α表达水平进行相对定量和绝对定量检测,为组胺对奶牛炎性信号通路产生的影响提供一定的依据。1.不同日粮精粗比对奶牛组胺和COX-2产生的影响随机选取6头泌乳期的成年健康奶牛,随机分组,采用2×2的拉丁方设计,对两组奶牛分别饲喂等能等氮的高精料日粮和低精料日粮,诱发亚急性瘤胃酸中毒,手术安装血管瘘管采集门静脉和肝静脉血液样品,组胺Elisa试剂盒检测血液中组胺含量,牛COX-2 Elisa试剂盒检测血液中COX-2的含量。结果表明,高精料组奶牛门静脉内组胺浓度较对照组均有所增加,高精料组组胺平均浓度(19.99±0.21ug/L)较低精料组(18.12±0.35ug/L)差异显著(P<0.05),而高精料组血液中平均COX-2浓度(38.36±0.32ng/ml)较低精料组(12.45±0.41ng/ml)也有显著提升(p<0.05)2.不同日粮精粗比下组胺差异对COX-2、NF-κB、IL-6、TNF-α基因表达的影响为了解不同日粮状况下奶牛体内组胺含量变化对肝脏内COX-2、NF-κB、 IL-6和TNF-α基因表达的影响,从分子水平研究奶牛肝脏对组胺反应的作用机理,本试验通过实时荧光相对定量PCR (RT-PCR)技术检测了高精料日粮状况下奶牛肝脏内COX-2、NF-κB、IL-6核TNF-α基因mRNA的表达变化,并分析了其与高精料时组胺浓度变化的关系。结果显示,高精料组NF-κB、COX-2、IL-6和TNF-α的表达较低精料组均有升高,且NF-κB、COX-2、IL-6和TNF-α四个基因的表达有显著升高(p<0.05)。本试验证明了奶牛SARA中血液内组胺浓度的升高可诱导肝脏对其转化和降解的效率增加,且组胺含量的增高可诱导奶牛肝脏中NF-κB信号通路的打开,进而导致COX-2等炎性基因表达。3.不同日粮精粗比下COX-2表达的绝对定量检测通过穿刺分别采取高精料组奶牛和低精料组奶牛的肝脏样品,提取总RNA并进行反转录,PCR反应后使用DNA凝胶回收试剂盒对DNA进行回收,得到的目的DNA连接19T-vector,之后转入感受态细胞DH5α进行大量培养。培养的菌液DNA测序后证实目的DNA成功导入后,使用试剂盒提取质粒,以质粒DNA为标准品分别稀释10、102、103、104、105、106、107和108倍,进行RT-PCR,得到COX-2扩增标准曲线,计算COX-2的表达量。结果发现：高精料奶牛COX-2的平均拷贝数(5320)较低精料牛(1690)均显著升高(P<0.05),差值为3630,平均升高比率为225%证明组胺含量的增高可导致COX-2表达增加。