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背景:由于肿瘤异质性,常导致肿瘤靶向治疗(如EGFR)和抗PD-1治疗的反应差异性和失败。传统的原发灶单点组织活检,仅代表部分肿瘤细胞克隆或亚克隆,缺乏转移灶信息。循环肿瘤细胞(CTCs)理论上来自体内多部位肿瘤,具有更好的代表性,含盖信息更为全面,肿瘤突变异质性可表现在CTCs基因组中,深入单个CTCs水平研究,有助于最终阐明肿瘤异质性现象和解析肿瘤进程中基因组发生的动态和持续性突变演化全貌。研究方法:1. 单个CTCs分离技术及肺癌患者检测。基于Cell Search原理,优化Ep CAM抗体,改进细胞破膜环节,肺癌患者抗凝外周血5ml,用Ep CAM免疫磁珠富集CTCs,经Ep CAM荧光信号放大、CD45、PD-L1和Hoechst免疫荧光染色鉴定CTCs,衔接显微操作分离单个CTCs,进行单细胞水平基因组DNA提取和扩增,采用肺癌72个靶基因定向测序,分析各基因突变拷贝数变异(CNV)和基因突变位点,进一步确证CTCs。共入组98例肺癌患者,分析临床检测CTCs效能。2. 肺癌组织与单个CTCs基因突变异质性分析。(1)EGFR基因突变异质性分析组织存在EGFR靶向治疗敏感突变的9个CTCs,分析CTCs之间、与组织间突变基因异质性;(2)CTCs之间临床关联驱动基因突变(ALK、BRAF、ROS1、RET、MET等)异质性分析。3. CTCs-PD-L1蛋白表达异质性及调控因子检测。(1)入组31例肺癌组织与CTCs匹配患者,建立CTCs-PD-L1蛋白水平检测方法,分析CTCs之间和组织PD-L1蛋白表达一致性;(2)测定外周血细胞因子IFN-γ等水平,分析细胞因子与CTCs-PD-L1表达相关性;通过不同细胞因子对肺癌细胞系PD-L1表达调节,确证IFN-γ是PD-L1表达主要调节细胞因子,体外验证CD137信号通路诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ,促进肺癌细胞自身PD-L1表达调控机制。结果:第一部分:外周血单个循环肿瘤细胞分离技术优化选择山羊抗鼠多克隆抗体(Goat Anti-Mouse p Ab,dylight488),对鼠抗人Ep CAM抗体免疫磁珠结合的肿瘤细胞,进行二抗标识染色,有效增加荧光强度,并简略细胞破膜环节,建立了基于Ep CAM~+鉴定CTCs和CD45~+排除白细胞的染色方案。在98例肺癌患者中,每5ml血液CTCs的检出率为86.7%,检出数目1-36个,中位数2个。经过肺癌关联72基因测序分析,存在高水平CNVs变异和基因突变,具有肿瘤细胞特征性分子变异。第二部分:肺癌单个循环肿瘤细胞基因水平异质性选取组织有EGFR突变的5例腺癌患者的CTCs共12个,其中4例患者的9 个CTCs获得肺癌关联72基因测序有效数据,立足单细胞水平解析基因突变异质性。所有CTCs样品采用NGS检测基因突变,组织蜡块采用ARMS法检测临床热点基因突变。结果显示,突变异质性普遍存在,包括:(1)同一病理类型CTCs间突变数量、类型及突变位点异质性;尽管病理类型一致,每个CTCs样品突变数量差异较大,存在异质性;(2)同一患者CTCs与肿瘤组织间EGFR突变异质性;(3)同一患者CTCs间突变数量、类型及突变位点异质性,在驱动基因普遍存在。第三部分:肺癌组织及CTCs在PD-L1蛋白水平异质性(1)优化出PD-L1-PE-CF594(M1H1)抗体检测PD-L1蛋白,建立基于CTCs的PD-L1检测方法,确认PD-L1~+CTCs鉴定标准为:Ep CAM~+/PD-L1~+/Hoechst~+/CD45~-。(2)CTCs的PD-L1表达存在明显异质性。分析了13个人肺癌细胞系PD-L1表达,显示PD-L1在不同肺癌细胞系表达不同,总阳性率为69.2%,以腺癌为主。57例患者CTCs-PD-L1异质性表达,PD-L1表达阳性比例为0-100%。(3)IFN-γ是主要PD-L1表达调节细胞因子。肺癌细胞CD137L可促进抗原诱导T淋巴细胞IFN-γ分泌增加,是上调肿瘤细胞PD-L1表达的一种主要机制。结论:(i)建立了新的CTCs染色方案,明显提高检出率,并能在基因水平进一步分析CTCs肿瘤细胞特性,为深入单个CTCs水平研究基因突变异质性,提供了有力技术手段。(ii)单细胞水平显示,肿瘤具有高度异质性,表现出肺癌关联基因突变数量和类型的差异性,可能直接关系到临床EGFR TKI治疗耐药和最终的治疗复发;单细胞水平研究表明单个CTCs富含基因信息,对深入解析肿瘤异质性更具价值,潜在的对靶向治疗方案设计、监测治疗反应有指导意义。本研究初步研究数据,仍有待细化解析CTCs复杂的生物信息改变。(iii)同一患者CTCs之间PD-L1表达存在差异,与配对组织的PD-L1表达也存在差异,预示临床PD-L1检测难以精确预测肿瘤对抗PD-1治疗反应性;肺癌细胞CD137L作为协同刺激分子,能诱导T细胞释放IFN-γ,促使肿瘤自身PD-L1表达增强,是一种潜在的肿瘤逃逸机制,提示CD137和PD-1/PD-L1抗体的联合治疗价值。