卵形鲳鲹TLR7亚家族及其信号通路相关基因的克隆与免疫应答分析

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TLR7亚家族由TLR7、TLR8和TLR9组成,分布于细胞内涵体,为Ⅰ型跨膜蛋白,分为胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区LRRs负责识别病原相关分子模式(PAMPs),胞内区TIR结构域可募集接头分子MyD88或TRIF,激活IRAK-4,活化IRF和NF-κB,诱导表达IFNs和促炎性细胞因子,从而启动先天性免疫和获得性免疫,抵御病原入侵。卵形鲳鲹是我国南方地区一种重要的海水养殖鱼类。近年来,随着高密度养殖的发展,由细菌或病毒感染引起的相关疾病频繁发生,导致鱼类大量死亡,给养殖业造成巨大的经济损失。因此,开展卵形鲳鲹免疫相关分子的克隆与免疫应答研究,具有重要的理论与现实意义。本研究克隆了卵形鲳鲹TLR7亚家族及其信号通路相关基因的全长cDNA,应用生物信息学软件分析蛋白质的结构和功能,采用qPCR检测上述各基因在健康鱼体组织中的表达,并分析用溶藻弧菌和PolyⅠ:C刺激后上述基因在脾脏和头肾组织中的表达变化。主要研究结果如下:1、卵形鲳鲹TLR7(TrTLR7)、TrTLR8和TrTLR9全长cDNA分别为4185bp、3432bp和3756bp,5’UTR分别为99bp、93bp和66bp;3’UTR 分别为945bp、267bp和519bp;ORF分别为3141bp、3072bp和3171bp,分别编码1046、1023和1056个氨基酸残基。预测蛋白序列均存在胞外区、跨膜区和胞内区,其中胞外区分别存在16、15和17个LRRs;胞内区均具有1个保守的TIR结构域。TrTLR7、TrTLR8和TrTLR9均与其它鱼类相应的蛋白同源性较高,分别为66.2%-80.4%、53.3%-76.3%和53.2%-77.6%。在NJ法构建的进化树上TrTLR7、TrTLR8和TrTLR9分别与其它鱼类聚为一支,表明它们的遗传关系亲近。2、TrMyD88、TrIRAK4、TrIRF3和TrIRF7全长cDNA分别为1213bp、 1606bp、1611bp和2083bp;5’UTR分别为63bp、62bp、64bp和69bp;3’UTR分别为283bp、134bp、104bp口691bp; ORF分别为867bp、1410bp、1431bp和1323bp,分别编码288、469、476和440个氨基酸残基。TrMyD88存在DD和TIR结构域;TrIRAK4具有DD和S-TKc结构域;TrIRF3和TrIRF7均具有IRF结构域和IRF-3结构域。TrMyD88、TrIRAK4、TrIRF3和TrIRF7均与其它鱼类相应的蛋白同源性较高,同源性分别为69.6%-84.7%、49.5%-77.3%、42.8%-82.4%和52.0%-81.7%,在NJ法构建的进化树上TrMyD88、TrIRAK4、TrIRF3和TrIRF7分别与其它鱼类聚为一支,表明它们的遗传关系亲近。3、qPCR检测结果显示,TrTLR7亚家族及其信号通路相关基因在健康鱼体组织中呈组成型表达。TrTLR7亚家族各成员在脾脏中表达最高,其次为鳃和肾脏等组织,TrTLR7禾口TrTLR8在肠中表达量最低,TrTLR9在肌肉中的表达量最低;TrMyD88在脾脏中表达最高,其次为肝脏和鳃等组织,肌肉中表达量最低;TrIRAK4在皮肤中表达量最高,其次为脾脏、和肝脏等组织,肠组织中表达量最低;TrIRF3和TrIRF7均在脾脏和肝脏等组织中表达较高,肠组织中表达量最低。4、卵形鲳鲹经溶藻弧菌刺激后,TrTLR7、TrTLR8、TrIRF3和TrIRF7的mRNA在头肾和脾脏中的表达上调,但不显著;TrTLR9、TrMyD88和TrIRAK4的mRNA在头肾和脾脏中表达显著上调(P<0.05)。经Polyl:C刺激后,TrTLR7和TrTLR8的mRNA在头肾和脾脏中表达显著上调(P<0.05); TrTLR9表达上调,但不显著;TrMyD8 8、TrIRAK4、TrIRF3和TrIRF7的mRNA在头肾和脾脏中表达水平均显著上调(P<0.05)。表明上述各基因均参与了溶藻弧菌和Polyl:C感染的免疫应答。
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