论文部分内容阅读
催乳素(Prolactin,PRL)是由单基因编码的多肽类激素,PRL不仅可以启动和维持哺乳动物泌乳,还会影响雌性动物卵巢发育和排卵,然而关于PRL对卵泡发育作用研究较少,PRL在绵羊卵泡发育过程中的作用机制未见报道。颗粒细胞作为卵泡的重要组成结构,除了可以支持卵泡生长外,颗粒细胞分泌的激素还可以维持卵母细胞发育成熟,因此可以通过探究PRL对绵羊颗粒细胞功能的影响来阐明PRL在卵泡发育及闭锁中的生物学功能。本试验以1岁左右小尾寒羊卵巢颗粒细胞为试验材料,通过外源添加不同浓度PRL培养颗粒细胞,利用CCK-8法测定颗粒细胞增殖、Annexin V-FITC/PI染色颗粒细胞、流式细胞仪检测颗粒细胞凋亡、ELISA试剂盒检测颗粒细胞培养液上清中雌激素(E2)和孕酮(P4)含量、qRT-PCR检测颗粒细胞凋亡和激素分泌相关基因相对表达量等方法,以期研究PRL对绵羊卵巢颗粒细胞增殖凋亡和激素分泌的影响,阐明PRL调节绵羊卵泡发育机制,试验主要获得以下研究结果:(1)在绵羊卵巢颗粒细胞体外培养体系,分别加入不同浓度的PRL(0、0.05、0.5、5μg/mL),连续培养颗粒细胞7d,每隔24h测得细胞活性(450 nm吸光度),并绘制颗粒细胞细胞生长曲线。结果显示,PRL促进绵羊颗粒细胞增殖,其中添加浓度为0.5μg/mL时PRL促进效果显著(P<0.05)。(2)检测不同浓度PRL(0、0.05、0.5、5 μg/mL)处理24 h和48 h后的绵羊颗粒细胞凋亡情况。结果显示,PRL处理颗粒细胞24h后,低浓度(0.05 μg/mL)PRL显著促进了颗粒细胞凋亡(P<0.05),而中浓度(0.5 μg/mL)和高浓度(5 μg/mL)PRL显著抑制了颗粒细胞凋亡(P<0.05);PRL处理颗粒细胞48h后,0.05、0.5、5μg/mLPRL的细胞凋亡率显著均低于对照组(P<0.05)。这表明PRL对于绵羊卵巢颗粒细胞凋亡作用与PRL浓度和作用时间有关,低浓度PRL短时间对于颗粒细胞凋亡为促进作用。(3)为探究PRL对颗粒细胞凋亡调节机制,不同浓度PRL(0、0.05、0.5、5μg/mL)处理绵羊颗粒细胞24 h后,检测促凋亡因子(Bax、p53和Caspase3)和抗凋亡因子(Bcl-2)mRNA表达水平。结果显示,添加PRL显著上调了颗粒细胞Bcl-2 mRNA表达量(P<0.05),并随PRL浓度升高而升高;添加低浓度(0.05 μg/mL)PRL显著上调了Bax、p53 mRNA表达量(P<0.05),添加中浓度(0.5μg/mL)和高浓度(5 μg/mL)PRL对Bax、p53和Caspase3 mRNA表达影响差异不显著(P>0.05)。这表明低浓度PRL上调促凋亡因子基因表达导致颗粒细胞细胞凋亡。(4)不同浓度PRL(0、0.05、0.5、5 μg/mL)处理绵羊颗粒细胞24h后,检测细胞上清液中E2和P4分泌含量。结果显示,添加PRL抑制了颗粒细胞E2的分泌,其中中浓度(0.5 μg/mL)和高浓度(5μg/mL)组的E2分泌显著低于对照组和低浓度(0.05μg/mL)组(P<0.05),添加PRL显著促进了颗粒细胞P4分泌(P<0.05),随着PRL添加浓度的升高P4分泌有升高趋势,但各试验组之间P4分泌差异不显著(P>0.05)。(5)不同浓度PRL(0、0.5 μg/mL)处理绵羊颗粒细胞24h、48 h和72 h,检测细胞上清液中E2和P4分泌含量。结果发现,0.5μg/mL PRL处理绵羊卵巢颗粒细胞24 h、48 h和72h后显著抑制E2分泌(P<0.05),PRL处理72 h后的E2分泌虽高于48h,但差异不显著(P>0.05);0.5 μg/mLPRL处理绵羊卵巢颗粒细胞24h、48 h和72 h后显著促进P4分泌(P<0.05),并且随着时间的延长P4浓度梯度增加,说明PRL对颗粒细胞抑制E2分泌和促进P4分泌作用不随时间延长而减弱。(6)不同浓度PRL(0、0.05、0.5、5 μg/mL)处理绵羊颗粒细胞24h后,检测FSHR、PRLR、LHR、CYP19、CYP11、3β-HSD和StAR基因相对表达量,结果表明,PRL 上调了FSHR、PRLR、LHR、CYP1 1、3β-HSD和StAR mRNA表达量,下调了 CYP19mRNA表达量。这表明PRL扩大了 FSH、LH信号传递,通过下调CYP19抑制绵羊颗粒细胞E2分泌,上调CYP1 1、3β-HSD和StAR表达量促进颗粒细胞P4分泌。综上所述,PRL促进了绵羊卵巢颗粒细胞增殖,对颗粒细胞的凋亡作用因PRL浓度不同而有差异,低浓度的PRL通过促进Bax、p53信号促使细胞凋亡。此外,PRL通过上调PRLR、FSHR、LHR mRNA表达量扩大了 FSH传导信号,下调CYP19抑制绵羊颗粒细胞E2分泌,上调CYP11、3β-HSD和StAR表达促进P4分泌,并且在一定时间内,PRL对颗粒细胞激素分泌影响并不减弱。本试验的研究结果为PRL对卵泡发育机制研究提供新的理论依据。