目的：　　 肺癌是世界上发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一,早期发现和诊断肺癌,对肺癌的治疗和预后有着重要的意义。常规细胞学检查因其简便,创伤小,且特异性较高,已普遍应用于肺癌的临床诊断。但由于标本质量,制片染色技术,读片人员经验等多方面的限制,其敏感性仍不尽如人意。而发现敏感有效的肺癌标记物则成为临床诊断肺癌的新途径。　　 纤支镜刷检因简便、快捷、经济、实用且准确性高而成为诊断肺癌的重要方法之一。然而,当癌细胞异型性不明显或数量较少时,临床上经常出现高度可疑为肺癌,反复的细胞学检查却是阴性的结果。胸腔积液是肺癌的常见并发症,癌病灶浸破脏层胸膜,癌细胞可同时或随后脱入胸腔内,形成胸腔脱落癌细胞。常规的细胞学检查是诊断恶性胸腔积液的标准方法,它主要依靠癌细胞的形态特点进行诊断,但对于较早期异型性不太明显的癌细胞与反应性间皮细胞几乎无法区别,以至造成诊断结果中存在着相当数量的假阴性。建立一组科学、有效的诊断方法是提高肺癌诊断阳性率的有效途径,也是提高肺癌患者生存率与治愈率的关键。　　 本课题以肺癌为主攻对象,以纤支镜刷检液基细胞学标本和胸腔积液为检测基础,采用RT-PCR方法测定良恶性刷检标本中SP1mRNA、VEGFmRNA及endostatinmRNA的表达:采用qPCR方法测定良恶性胸腔积液中hTERT扩增情况;探讨这几种标记物与细胞学诊断结果之间的关系及对诊断肺癌的临床应用价值。　　 方法：　　 收集中国医科大学附属第一医院2009年至2011年门诊及住院肺癌患者术前纤维支气管镜刷检标本144例以及胸腔积液115例。其中纤支镜标本中有鳞癌50例,腺癌16例,小细胞癌25例,以及良性疾病53例(包括炎症41例和结核12例);胸腔积液标本中有腺癌60例,小细胞癌9例,以及良性疾病46例(包括炎症31例和结核15例)。　　 一、逆转录聚合酶链反应　　 (一)提取mRNA　　 1、标本的处理,离心:　　 将支气管镜刷检标本置于离心管,2000r/min,5min离心,弃上清,取沉渣。　　 2、TRIZOL法提取mRNA:　　 RNA可进行mRNA分离,或保存于-70℃冰箱。　　 (二)RT-PCR:　　 1、cDNA第一链合成。　　 2、聚合酶链式反应35个循环。　　 (三)电泳:　　 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染法显色。　　 (四)分析结果:　　 分析良恶性标本中SP1mRNA、VEGFmRNA及endostatinmRNA的表达。　　 二、实时定量聚合酶链反应　　 (一)提取DNA　　 1、标本的处理,离心:　　 将胸腔积液标本置于离心管,2000r/min,30min离心,弃上清,取沉渣。　　 2、试剂盒法提取DNA:　　 DNA保存于-20℃冰箱。　　 (二)qPCR:　　 1、制备标准曲线。　　 2、聚合酶链式反应35个循环,生成熔解曲线。　　 (三)分析结果:　　 1、相对定量法计算hTERT基因拷贝数。　　 2、生成ROC曲线,设定阈值。　　 3、分析良恶性标本中hTERT基因扩增情况。　　 结果：　　 (一)SP1mRNA、VEGFmRNA及endostatinmRNA在纤支镜标本中的表达　　 1、SP1mRNA、VEGFmRNA及endostatinmRNA的表达在肺癌与肺良性病变中的差异具有显著性(P＜0.01),且VEGF的表达在结核和炎症组有明显差异(P＜0.01)。　　 2、在恶性组中,SP1mRNA和VEGFmRNA表达明显高于endostatinmRNA(P＜0.01),然而endostatinmRNA在肺良性病变中无一例阳性表达。　　 3、三种检测指标单一及两两联合应用对肺癌与肺良性病变诊断效能的比较,其中RT-PCR检测VEGFmRNA检测有很好的诊断效能:敏感性(89.0%),准确性(88.9%);而VEGFmRNA与endostatinmRNA平行联合应用有着最好的诊断效能:敏感性(93.4%),准确性(91.7%)。它们均显著高于细胞学检测。　　 (二)hTERT基因在胸腔积液中的扩增　　 1、hTERT基因相对拷贝数在恶性与良性胸腔积液中的差异具有显著性(P＜0.01)。　　 2、hTERT基因扩增在恶性与良性胸腔积液中的差异具有显著性(P＜0.01),且其检测的敏感性高于细胞学(P＜0.01)。　　 结论：　　 1、利用RT-PCR方法联合检测SP1、VEGF及endostatin在转录水平上的表达,对纤支镜刷检细胞诊断肺癌有重要的临床应用价值。　　 2、利用qPCR方法检测TERT基因水平的扩增,对肺癌性胸腔积液的诊断有重要的临床应用价值。