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第一部分：Kupffer细胞内毒素耐受时TRAF3基因、蛋白表达及K-48泛素化水平变化目的：观察内毒素耐受时，Kupffer细胞（KCs）内肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)基因及蛋白表达变化，K-48泛素化水平以及下游细胞因子的分泌情况。方法：采用离体胶原酶消化、密度梯度离心联合选择性贴壁法分离KCs，F4/80免疫荧光染色鉴定KCs的纯度，台盼蓝拒染及吞墨实验判断KCs的活性及吞噬功能，光镜下动态观察KCs随时间的形态变化。将分离、培养的KCs以3-4×106密度接种于六孔板中，并随机分为2组：①内毒素耐受组（ETT Group）：给予10ng/mlLPS刺激24h后再给予300ng/ml LPS刺激；②内毒素非耐受组(NETTGroup)：直接给予LPS刺激（300ng/ml）。两组分别在处理后0，5，10，30，60min收获细胞。荧光实时定量PCR（Q-PCR）检测TRAF3mRNA表达变化，Western blotting及激光共聚焦检测TRAF3蛋白变化及K48泛素化（K48-Ub）水平；ELISA法检测KCs培养上清液中IL-1、IL-10，TNF-α的分泌情况。结果：（1）免疫荧光染色可见F4/80分子在细胞膜强表达，KCs纯度大于92.0%，台盼蓝染色显示细胞的活力均在98.5%以上，吞墨试验见KCs吞噬大量碳素颗粒。（2）内毒素耐受组与非耐受组TRAF3的mRNA表达量显著在各个时间点无显著性差异（P>0.05）；但耐受组TRAF3蛋白表达量在观察时间段内显著高于非耐受组（P<0.05）；耐受组与非耐受组相比，K-48泛素化水平明显降低（P<0.05）。（3）耐受组细胞培养上清液中IL-1、TNF-α的量显著低于非耐受组（P<0.05）；耐受组IL-10分泌量显著高于非耐受组（P<0.05）。结论：内毒素耐受时KCs细胞中TRAF3基因表达无明显变化，TRAF3蛋白K-48泛素化降解受阻，导致TRAF3蛋白表达量相对增高。第二部分：抑制TRAF3泛素化降解对MAPK及TRIF信号通路的影响目的：细胞凋亡抑制蛋白2（cIAP2）是TRAF3的特异性泛素连接酶，本实验通过降低cIAP2的表达来抑制TRAF3的泛素化降解，探讨TRAF3的降解被抑制后对KCs内MAPK及TRIF信号通路的影响。方法：将分离纯化的KCs以3-4106密度接种于六孔板中，随机分为两组：①转染组：构建载有cIAP2-shRNA的慢病毒质粒，转染48h后给予LPS（300ng/ml）刺激。②对照组：转染空载质粒48h后给予LPS（300ng/ml）刺激。两组分别于处理后0，5，10，30，60min收获细胞，激光共聚焦检测cIAP2、TRAF3及K-48Ub蛋白表达；Westernblotting检测cIAP2、TRAF3、K-48Ub、JNK、p-JNK、p38、p-p38、TRIF及IRF3蛋白表达水平变化；ELISA检测细胞上清液中IL-1、TNF-α、IL-10的含量变化蛋白变化。结果：（1）转染组cIAP2、K-48Ub蛋白表达量在各时间点显著低于对照组（P<0.05）。（2）转染组TRAF3、TRIF及IRF3蛋白表达量显著性高于对照组（P<0.05）。（3）两组JNK、p38蛋白表达量无明显变化；转染组p-JNK和p-p38蛋白表达量显著低于对照组（P<0.05）。（4）转染组细胞培养上清液中IL-1、TNF-α的量显著低于对照组（P>0.05），IL-10的量显著高于对照组。结论：抑制TRAF3的泛素化降解可以负性调控MAPK信号激活，正性调控TRIF信号活化，诱导KCs产生内毒素耐受。第三部分：下调TRAF3的表达对Kupffer细胞内毒素耐受的影响目的：探讨下调TRAF3的表达对KCs内MAPK、TRIF信号通路活化以及内毒素耐受的影响。方法：将分离纯化的KCs以3-4106密度接种于六孔板中，随机分为三组：①转染组：构建载有TRAF3-shRNA的质粒，转染24h后给予小剂量LPS（10ng/ml）刺激，24h后再给予大剂量LPS（300ng/ml）刺激。②内毒素耐受组：转染空载质粒24h后给予小剂量LPS（10ng/ml）刺激，等待24h后再给予大剂量LPS（300ng/ml）刺激。③内毒素非耐受组：转染空载质粒24h后直接给予大剂量LPS（300ng/ml）刺激。三组分别于处理后0，30，60min收获细胞，Western blotting检测TRAF3、JNK、p-JNK、p38、p-p38、TRIF及IRF3蛋白表达水平变化；ELISA检测细胞上清液中IL-1、TNF-α、IL-10的含量变化蛋白变化。结果：（1）转染组TRIF及IRF3蛋白表达量在各时间点显著低于内毒素耐受组（P<0.05），但高于内毒素非耐受组（P<0.05）。（2）三组JNK、p38蛋白表达量没有明显变化；转染组p-JNK和p-p38蛋白表达量显著高于内毒素耐受组（P<0.05），但低于内毒素非耐受组（P<0.05）。（3）转染组细胞培养上清液中IL-1、TNF-α的量显著高于内毒素耐受组（P<0.05），明显低于内毒素非耐受组（P<0.05）。（4）转染组细胞培养上清液中IL-10的量显著低于内毒素耐受组（P<0.05），但高于内毒素非耐受组（P<0.05）。结论：降低KCs内TRAF3的蛋白表达损害内毒素耐受的建立，但并不能完全消除内毒素耐受效应。