神经系统自身免疫性疾病是以免疫细胞、免疫分子等攻击神经系统为主要病理机制的疾病,可发生于中枢、周围神经系统及神经-肌肉接头等处,导致神经元或轴索损伤、髓鞘脱失、神经-肌肉接头处破坏等病理改变。　　由于中枢神经系统自身免疫性疾病兼具自身免疫性疾病的复杂性及中枢神经系统疾病致死、致残等严重性的特点,其发病机制与治疗的研究成为近年来研究的热点与焦点。靶向治疗以直接作用于受损细胞而不损伤正常细胞的理念,越来越受到人们的重视,包括基因治疗、RNA干扰技术、小分子靶向药物等。基因治疗是指通过操作遗传物质来干预疾病的发生、发展和进程,包括替代或纠正人自身基因结构或功能上的错乱,杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等,从而达到治疗的目的。　　在基因治疗过程中,将目的基因导入靶细胞的转基因载体是基因治疗能否成功的关键,也是目前基因治疗的瓶颈。应用于基因治疗的载体主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体转染效率高,是最早用于被基因治疗的重要工具,但存在潜在感染、免疫原性,体内不能重复使用,携带目的基因的大小受到限制等缺点。而非病毒载体的阳离子聚合物是目前生物医学领域的研究热点,其优点包括:(1)无免疫原性,不会引起机体的免疫反应,具有良好的生物相容性;(2)可与DNA或RNA形成纳米粒;(3)通过控制粒径尺寸和表面性质可控制载体的生化特性;(4)可根据需要灵活设计分子结构;(5)遗传物质的释放可做到由聚合物基质的降解速率决定;(6)表面大量的阳离子基团,提供了进一步功能化的可能。　　本研究内容主要分为两部分:　　1.树枝状阳离子聚合物OD-Ds-PAMAM的合成和化学表征,检测其形成纳米复合体的粒径、zeta-电位、形态和结构和对DNA的包裹、保护能力等;　　2.OD-Ds-PAMAM载体聚合物的生物学表征,通过体外细胞毒性检测及转染试验,从中筛选出高转染效率、低细胞毒性的载体化合物,并评价其在神经系统疾病基因治疗中的应用价值。　　第一部分:树枝状阳离子聚合物OD-Ds-PAMAM的合成和化学表征　　目的:　　通过化学方法表征OD-Ds-PAMAM与pDNA形成复合物后的性质,并进一步检测其对DNA的包裹、浓聚、保护能力。　　方法:　　以聚酰胺-胺PAMAM dendrimers为骨架,结合树枝状分子基源葡聚糖衍生物(Oxidized Dextran,OD-Ds,s=2、3、4),并优化合成条件,通过化学方法表征产物的性质。按照一定的N/P比(N/P比是指阳离子聚合物中NH4+与DNA中PO3-的摩尔比例),阳离子聚合物OD-Ds-PAMAM与DNA均匀混合形成复合物后,在ZetaPALS-电位分析仪上测定纳米复合体的粒径和表面电荷,电子透射显微镜观察纳米复合体的形态和结构。通过琼脂糖凝胶电泳实验研究OD-Ds-PAMAM负载质粒DNA的能力,通过抗核酸酶降解实验研究OD-Ds-PAMAM保护质粒DNA的能力。　　结果:　　1.纳米材料复合体的粒径和zeta-电位　　OD-Ds-PAMAM/pEGFP-N3纳米复合体粒径随着N/P从10到60的增大而减小,稳定在140-200nm之间;OD-Ds-PAMAM/pEGFP-N3纳米复合体表面电荷随着N/P比值的增大而增大,在N/P≥40时,电位趋于稳定。　　2.纳米材料复合物的形态和结构　　通过透射电子显微镜观察OD-Ds-PAMAM/pEGFP-N3在N/P比为20和40时形成的纳米复合体粒径大小不超过200nm,呈实心球体,粒子分布均匀,随着N/P比值增加,球体缩小。　　3.琼脂糖凝胶电泳　　OD-Ds-PAMAM与pEGFP-N3按照N/P比为0.5、1、5、10、20、30、40混合后进行琼脂糖凝胶电泳,结果提示OD-D3-PAMAM和pDNA在N/P比为5时可充分结合,OD-D4-PAMAM和pDNA在N/P≥1时即达到完全结合,而阳性对照组PEI25KD则在N/P≥10时才能完全结合pDNA。　　4.抗核酸酶实验　　可见游离的裸质粒DNA分子被DNA酶完全降解,相反,用强离子去污剂SDS解离复合物,对分离出的DNA分子进行电泳分析,未发现断裂或降解的pDNA。说明OD-Ds-PAMAM阳离子聚合物可以保护DNA分子免受核酸酶的降解。　　结论:　　共合成3种OD-Ds-PAMAM树枝状阳离子聚合物,能有效结合质粒DNA分子,结合后的复合物直径在140-200nm之间,表面带正电荷,能与细胞膜结合并被内吞。为评估OD-Ds-PAMAM在体外的基因转染效率及细胞毒性作用提供实验依据。　　第二部分:树状阳离子聚合物OD-Ds-PAMAM作为传输载体的生物学表征　　目的:　　通过体外细胞学实验检测载体聚合物OD-Ds-PAMAM的细胞毒性与基因转染能力,优化转染条件,并从中筛选出毒性低、转染效率高的化合物,为进一步体内试验奠定实验与理论基础。　　方法:　　以市场上应用较广泛、同属非病毒载体阳离子聚合物类的聚乙烯亚胺(Polyethyleimine,PEI)作为阳性对照组,体外培养人胚肾HEK293细胞和神经母瘤SH-SY5Y细胞,并制备含有增强型EGFP基因的表达载体pEGFP-N3,利用噻唑蓝(MTT)比色实验研究OD-Ds-PAMAM/PEGFP-N3载体复合物的细胞毒性作用。然后分别用OD-Ds-PAMAM和PEI两种载体将pEGFP-N3转染到不含血清培养和含10％胎牛血清培养基的人胚肾HEK293细胞和神经母瘤SH-SY5Y细胞中,转染后分别于24或36h用倒置荧光显微镜及流式细胞仪观察转染效果和检测转染效率。　　结果:　　1.细胞毒性试验:　　在人胚肾HEK293细胞和神经母瘤SH-SY5Y两种细胞系当中,均可见OD-Ds-PAMAM系列材料显示出低毒性,三种材料的细胞毒性总体上呈现OD-D4-PAMAM>OD-D3-PAMAM>OD-D2-PAMAM的趋势。阳性对照组PEI25KD在低浓度时就开始出现明显的细胞毒性,在100μg/ml时细胞几乎全部死亡。OD-D4-PAMAM较对照组PEI25KD显示出较低的细胞毒性,当OD-D4-PAMAM纳米材料浓度为50μg/ml,细胞存活率仍有60.6%(HEK293细胞系中)和71.1%(SH-SY5Y细胞系中)(p<0.01)。　　2.细胞转染试验:　　两种细胞中,流式细胞仪下研究结果发现,OD-Ds-PAMAM系列纳米材料的转染效率与N/P值有关,当N/P值逐渐增加,转染效率随之增加,而当N/P值达到一定值,表达量不再增加,处于一段平台期后反而下降。人胚肾HEK293中,无血清转染条件下,三种纳米材料的转染效率呈现OD-D2-PAMAM