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α-葡萄糖苷酶属于外切糖苷酶,能够催化底物的非还原末端的裂解,以释放α-D-葡萄糖,同时被认为在水解淀粉产生不可发酵糖的过程中起重要作用,此外α-葡萄糖苷酶能将游离的葡萄糖残基转移到另一糖类底物上,从而生产低聚异糖类。来自α-葡萄糖苷酶的转苷用于产生葡萄糖基化合物或低聚异麦芽糖。黑曲霉α-葡萄糖苷酶的生产通常伴随着糖化酶,糖化酶的存在使α-葡萄糖苷酶可以利用的淀粉减少,从而抑制了α-葡萄糖苷酶的水解和转化底物的能力。糖化酶是具有外切酶活性的酶,主要催化淀粉,糖原和寡糖中的α-1,4-糖苷键水解,它也以较低的速率水解α-1,6-糖苷键,糖化酶在工业生产中也经常受到α-葡萄糖苷酶的转苷反应的影响,导致葡萄糖产量的显着降低。由于可以水解相同的底物,因此α-葡萄糖苷酶和糖化酶可能竞争性地彼此抑制。在本研究中,通过靶向基因缺失敲除黑曲霉的糖化酶基因,构建具有较高α-葡萄糖苷酶活性的黑曲霉突变菌株,并研究糖化酶对α-葡萄糖苷酶活性的影响。本文采用同源重组的方法得到黑曲霉糖化酶基因缺失突变体,首先在黑曲霉基因组的上下游分别扩增约1,000 bp左右的片段,同时从质粒pBC-Nours.R载体中扩增得到诺尔丝菌素抗性基因,通过Overlap PCR构建基因敲除表达盒GA1-NR和NR-GA2,并通过原生质体转化获得具有抗性基因的转化子,在含有125μg/mL诺尔丝菌素的培养基上筛选转化子,并通过PCR进一步证明筛选的阳性转化子。对得到的黑曲霉糖化酶基因缺失突变菌株ΔGA进行表型分析,生长情况测定,α-葡萄糖苷酶和糖化酶酶活测定,α-葡萄糖苷酶基因在黑曲霉突变菌株中的相对表达量的测定以及α-葡萄糖苷酶转苷作用的分析。根据对突变菌株ΔGA的分析,由于糖化酶基因的缺失,培养基上的ΔGA突变体的生长速度在一定程度上减缓。但在生长发育如菌落表型,形态和色素沉着中没有明显的缺陷。此外,对α-葡萄糖苷酶酶活的测定可知,相比于出发菌株,突变菌株ΔGA的α-葡萄糖苷酶活性升高了63.08%,而突变菌株损失部分糖化酶活性,糖化酶酶活降低了21.14%,说明糖化酶基因的敲除有利于α-葡萄糖苷酶活力的增强。并且通过RT-qPCR证实了在ΔGA中α-葡萄糖苷酶基因表达水平提高至出发菌株的2.53倍,说明糖化酶基因的敲除有利于α-葡萄糖苷酶基因表达量的增加。高效液相色谱法检测突变菌株ΔGA与出发菌株的转苷产物,其中ΔGA转苷生产异麦芽糖的浓度为出发菌株的2.00倍,潘糖的浓度为出发菌株的1.59倍,说明糖化酶基因的敲除有利于α-葡萄糖苷酶转苷产物浓度的提升。综上所述,本研究实现了黑曲霉糖化酶基因的敲除,获得了黑曲霉突变菌株ΔGA。进一步证明糖化酶对α-葡萄糖苷酶的活性具有负面的影响作用,并获得了具有更高α-葡糖苷酶活性的黑曲霉HE01突变株ΔGA,为工业上提供具有可应用价值的α-葡萄糖苷酶生产菌株。