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本研究建立了纯培养和非培养微生物脂肪酶基因克隆的有效方法,并分别利用该方法克隆了葡枝根霉YF6脂肪酶基因和宏基因组脂肪酶基因Lip42,构建了高通量的毕赤酵母表面展示表达载体pAMB129,实现了葡枝根霉脂肪酶基因LipRs在毕赤酵母中的展示表达,研究了葡枝根霉全细胞催化合成生物柴油的反应条件,对宏基因组脂肪酶基因Lip42在毕赤酵母中的分泌表达进行了系统研究。具体摘要如下:1.筛选并鉴定了1株高产脂肪酶菌株葡枝根霉YF6,并采用简并PCR等分子技术从中克隆到1个新的脂肪酶基因LipRs及其对应的全长cDNA,序列分析表明该基因编码区全长1 173 bp,不含内含子序列,编码1段由26个氨基酸残基组成的信号肽和1个由365个氨基酸残基组成的成熟蛋白,有5个可能的N-糖基化位点,含有脂肪酶特征序列GHSLGGA,与来自米根霉的脂肪酶(AAF32408)同源性最高,一致性为83%。基因序列提交GenBank,登录号为DQ139862。2.构建了基于啤酒酵母絮凝蛋白Flo1的新型高通量毕赤酵母表面展示表达载体pAMB129,为了验证其有效性,葡枝根霉脂肪酶基因LipRs被克隆到絮凝蛋白N-端编码序列的下游,转化毕赤酵母,研究其表达情况。结果表明,重组的毕赤酵母菌株可以在橄榄油-罗丹明平板上表现出脂肪酶活性,并经过激光共聚焦显微镜观察,验证了构建的毕赤酵母展示表达载体的有效性,同时实现了葡枝根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的展示表达。3.以聚氨酯为葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)YF6固定化培养载体,制成干燥的固定化YF6全细胞催化剂。用它进行酯化反应,油醇解反应最适醇油比为3:1,甲醇分3次加入,在反应温度35℃条件下,其酯化率最高达到89%左右。它不仅能使菜籽油、大豆油等油料直接经转酯化反应,生成脂肪酸甲酯,而且也能催化高酸值的废弃油的酯化反应形成生物柴油。4.采用简并PCR等分子技术从餐馆灶台油污宏基因组中克隆到脂肪酶基因Lip42及其对应的全长cDNA,序列分析表明脂肪酶基因的cDNA编码区序列全长为1692bp,编码1段由19个氨基酸残基组成的信号肽和1段由544个氨基酸残基组成的成熟肽,有2个可能的N-糖基化位点,BLAST比对分析表明该序列与已发表的白地霉(Geotrichum geotrichum)脂肪酶基因( U02541)在核苷酸水平的一致性为99%。该基因序列提交GenBank,登录号为DQ313172。将该脂肪酶基因的开放阅读框克隆到毕赤酵母表达载体,转化毕赤酵母GS115,经罗丹明B平板功能筛选得到具脂肪酶活性的重组毕赤酵母菌株[GS115(pAMB768)]。利用3种培养基(MM、BMM和BMMY)4种甲醇诱导浓度(0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)在22℃恒温摇床中对重组菌株[GS115(pAMB768)]进行诱导表达,研究发现BMMY培养基在甲醇浓度为0.5%条件下表达量最高,纯化后计算表明粗酶液最高脂肪酶酶活为50.60 U/mL,重组脂肪酶的最高产量为147.93 mg/L培养基。重组脂肪酶经3步法纯化后,SDS-PAGE电泳表明该脂肪酶的表观分子量为68 kd,而以橄榄油为底物时其最适反应温度为30°C,最适反应pH值为pH 8.0。金属离子和去污剂对脂肪酶活性有较大影响,研究结果表明Mg2+对重组脂肪酶活性有促进作用,而Ca2+、K+、Fe2+、Cu2+和Co2+则抑制其活性, Tween 20、Triton-X100和SDS可以强烈抑制重组脂肪酶活性。