【摘 要】
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研究目的:心脏瓣膜病是心脏大血管外科中非常常见的心脏疾病,瓣膜置换术是目前临床上主要且有效能改变结局的治疗手段。然而术后产生的钙化,栓塞导致瓣膜衰坏一直是医务人员需要攻克的难题。我们通过构建去细胞猪主动脉瓣组织工程心脏瓣膜,利用其良好的组织相容性、自我修复性和终生耐久性来探寻一种理想的瓣膜替代物。从而改善心脏瓣膜病患者术后出现病理性钙化和血小板血栓形成这两个主要的严重并发症,降低患者需要再次手术的
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研究目的:心脏瓣膜病是心脏大血管外科中非常常见的心脏疾病,瓣膜置换术是目前临床上主要且有效能改变结局的治疗手段。然而术后产生的钙化,栓塞导致瓣膜衰坏一直是医务人员需要攻克的难题。我们通过构建去细胞猪主动脉瓣组织工程心脏瓣膜,利用其良好的组织相容性、自我修复性和终生耐久性来探寻一种理想的瓣膜替代物。从而改善心脏瓣膜病患者术后出现病理性钙化和血小板血栓形成这两个主要的严重并发症,降低患者需要再次手术的风险,减轻患者的经济和心理的双重负担。研究方法:1、消化法提取大鼠瓣膜间质细胞,镜下观察瓣膜间质细胞,利用α-SAM和Vimentin染色对细胞进一步鉴定。2、构建体外瓣膜间质细胞钙化模型,通过检测瓣膜间质细胞的转录,翻译,茜素红染色和碱性磷酸酶染色来评估模型,并筛选出转染效率最高的siRNA-RunX2。3、利用纳米粒自组装技术进一步的修饰负载,最终制备得到了纳米递送系统MSN@VEGF-PEI-siRNA。并通过检测纳米载药系统的表征,负载量,药物释放,细胞毒性。4、采用纳米递送系统MSN@VEGF-PEI-siRNA对瓣膜间质细胞进行转染,通过茜素红染色、ALP染色、Western blot、PCR等评估纳米递送系统MSN@VEGF-PEI-siRNA的抗钙化效应。5、加入纳米递送系统MSN@VEGF-PEI-siRNA与大鼠内皮细胞共培养,通过评估内皮细胞的增殖,黏附,成管,迁移来评估纳米递送系统体外加速内皮化的能力。6、将MSN@VEGF-PEI-siRNA负载在肝素化的去细胞猪主动脉瓣上,制备得到新型复合瓣膜支架,并扫描电镜进行表征以及评估生物学性能。研究结果:1、显微镜下观察瓣膜间质细胞大部分为不规则形,免疫荧光染色显示α-SAM及Vimentin抗体阳性。2、PCR、Western blot、茜素红染色、ALP染色以及相关钙化基因的表达显示体外瓣膜间质细胞钙化模型建立顺利,并利用siRNA沉默基因RunX2,PCR、Western blot、染色结果显示抗钙化性能较好。3、通过扫描电镜及透射电镜表征了MSN、MSN@VEGF-PEI、及MSN@VEGF-PEI-siRNA。显示三者纳米粒径约在49nm左右,在适宜的浓度（0.75mg/m L）不显示细胞毒性,且药物的负载量分别为82.37%（VEGF）和78.81%（siRNA）,分散性好。4、茜素红染色、ALP染色、PCR、Western blot结果显示出了MSN@VEGF-PEI-siRNA很好的转染效率。5、MSN@VEGF-PEI-siRNA纳米载体不管是在大鼠内皮细胞的增殖,黏附,成管,迁移四个方面较MSN和MSN-PEI-siRNA都显示出了更好的效果。6、扫描电镜显示新型功能化瓣膜支架DPAV-MSN@VEGF-PEI-siRNA构建顺利,初步显示了抗钙化效应及加速内皮化的效应。研究结论:基于介孔二氧化硅纳米粒负载siRNA-RunX2和VEGF修饰去细胞猪主动脉瓣的新型复合瓣膜支架显示了很理想的抗钙化和加速内皮化能力,有望成为一种新型的瓣膜替代物应用于临床。
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