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耐抗生素和除草剂的筛选标记基因在植物基因组和叶绿体遗传转化过程中起着至关重要的作用。但因其存在的潜在生态安全和对人类健康的危害等问题,对于标记基因的应用一直颇受争议。近年来,对转基因是否安全等问题的讨论一直争论不休,加上政府监管要求更加严格,迫切的需求一种安全的替代选择系统。已发现,细菌四吡咯分子合成的关键酶谷氨酸-1-半醛氨基转移酶(glutamate-1-semialdehydeaminotransferase,GSAT)的突变体耐专一性抑制剂3-氨基-2,3-二氢苯甲酸(Gabaculine)。它可以作为植物基因组转化的安全筛选标记基因。为此,我们尝试以玉米GSAT作为植物核基因组和叶绿体基因组筛选标记,构建相关载体,获得以下主要结果: 1.根据本实验室已构建好的玉米GSAT突变体基因(mGSATM),设计引物,PCR扩增,将扩增片段酶切,插入pCAMBIA1301,取代GUS基因,构建核遗传转化表达载体。 2.采用前人改进的高离子浓度低pH法,提取获得了烟草叶绿体基因组DNA,电泳检测表明叶绿体基因组DNA符合要求,设计引物,扩增叶绿体同源重组片段trnA和trnI,测序结果表明和公布的序列同源性达99％。 3.利用重叠PCR技术,分别在叶绿体常用筛选标记壮观霉素抗性基因aadA和本实验安全筛选标记基因mGSATM前插入叶绿体来源的启动子prrn,并将叶绿体来源的终止子psbA加在mGSATM基因后面。然后将叶绿体同源重组片段trnA、trnI分别插入两端,构建玉米GSAT突变体作为筛选标记的烟草叶绿体遗传转化表达载体,序列为:trnI-prrn-aadA-prrn-gsatm-psbA-trnA。 4.将含有玉米GSAT突变体基因的核遗传转化表达载体进行烟草转化,实验初步获得转基因植株。 综上所述,本研究构建了玉米GSAT突变体作为筛选标记的核遗传转化表达载体,构建玉米GSAT突变体作为筛选标记的烟草叶绿体遗传转化表达载体为筛选新型安全标记奠定基础。