【摘 要】
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由病毒引起的呼吸道感染,特别如2019年末由新型冠状病毒引起的新冠肺炎大流行,对全球公共卫生构成巨大威胁。为实现急性呼吸道疾病的快速诊断和及时治疗,有效控制传染病疫情扩散,开发高灵敏度、高特异性、快速简便的呼吸道病毒检测方法具有非常重要的意义。本论文针对开展商业化呼吸道病毒检测的预研需求,结合微流控技术和胶体金可视化检测方法,开发了基于微流控技术的呼吸道病毒免疫检测和基于微流控和RPA-CRISP
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由病毒引起的呼吸道感染,特别如2019年末由新型冠状病毒引起的新冠肺炎大流行,对全球公共卫生构成巨大威胁。为实现急性呼吸道疾病的快速诊断和及时治疗,有效控制传染病疫情扩散,开发高灵敏度、高特异性、快速简便的呼吸道病毒检测方法具有非常重要的意义。本论文针对开展商业化呼吸道病毒检测的预研需求,结合微流控技术和胶体金可视化检测方法,开发了基于微流控技术的呼吸道病毒免疫检测和基于微流控和RPA-CRISPR/LbCas12a的呼吸道病毒核酸检测方法。主要研究内容如下:（1）微流控芯片的制备。采用AutoCAD绘制微流控芯片2D结构,分别选用聚二甲基硅氧烷（PDMS）及聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）两种材料进行微流控芯片的制备,比较了两种芯片的制备工艺及材料适用性。结果表明,PDMS材料具有比PMMA材料更强的疏水性,且改性后的PMMA芯片的亲水性优于PDMS芯片。为增加芯片亲水性,减少对蛋白质的非特异性吸附,选择PMMA材料作为后续微流控芯片的制备基材。（2）基于微流控技术的呼吸道病毒可视化免疫检测。通过芯片设计将进样区、包被溶解区、混合区、检测区集成在微流控芯片上。以注射泵作为流体驱动力,通过精准的流体控制实现了甲型流感H1N1、乙型流感灭活病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒标准抗原的可视化检出,总体检出时间为10 min,单次所消耗样本量为80μL。芯片对甲型流感抗原、乙型流感抗原、呼吸道合胞病毒抗原和新型冠状病毒抗原的检出限分别为37.6 ng/m L,17.8μg/m L,112.5 ng/m L和0.05 ng/m L。所研制的免疫微流控芯片具有特异性高、所需样品量少、操作简便、检测快速、无交叉反应等特点,可实现呼吸道病原体的快速检出,及时区分新冠肺炎与普通呼吸道感染,提高疫情防控效率。该技术可用于POCT现场快速检测。（3）基于微流控RPA-CRISPR/LbCas12a的呼吸道病毒可视化核酸检测。通过芯片设计将RPA恒温扩增,CRISPR/LbCas12a检测,胶体金侧流层析试纸条可视化检测集成在微流控芯片上,实现甲流、乙流、新冠病毒的核酸检测。胶体金侧流层析试纸条对甲型流感病毒质粒、乙型流感病毒质粒、新型冠状病毒质粒以及新型冠状病毒假病毒的检出限分别为2.33×10~2copies/μL,8.76×10~1copies/μL,1.38×10~2copies/μL和8.4×10~2copies/μL。整个反应可于37℃恒温条件下进行,60分钟可得检测结果,无需昂贵的核酸扩增仪器及复杂的核酸扩增程序。
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